段寶軒，李詩浩，王洪海，李春利，盧一凡

(1.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130；2.河北工業(yè)大學(xué)化工過程集成與資源利用節(jié)能國家地方聯(lián)合工程實驗室；3.天津大學(xué)化工學(xué)院生化工程系和系統(tǒng)生物工程重點實驗室(教育部))

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21878066)；河北省自然科學(xué)基金項目(B2019202167)。

酶促反應(yīng)精餾(ERD)技術(shù)采用固定化酶替代傳統(tǒng)的酸堿催化劑，具有反應(yīng)條件溫和、底物選擇性高等優(yōu)點，備受研究者們的青睞。但是ERD的工業(yè)應(yīng)用受到酶催化劑成本和穩(wěn)定性等因素的限制，研究人員開發(fā)了多種固定化酶的制備方法來克服上述限制因素[1-4]。固定化酶珠和溶膠-凝膠法是用于實驗室規(guī)模ERD的兩種常見的固定化酶制備方法[5-6]。固定化酶珠可以很好地保留酶的活性，因此其更適合于工業(yè)規(guī)模ERD的應(yīng)用[5]。目前，用于實驗室規(guī)模ERD的固定化酶珠主要是商業(yè)固定化脂肪酶Novozyme435，但是由于其成本和長效性限制，以及工業(yè)ERD規(guī)模龐大且反應(yīng)條件苛刻，有必要開發(fā)可替代Novozyme435的具有成本和穩(wěn)定性優(yōu)勢的新型固定化酶催化劑[7]，使其在嚴(yán)苛的工業(yè)反應(yīng)條件下，也能發(fā)揮良好的催化性能。

聚乙二醇化定義為聚乙二醇(PEG)與生物活性物質(zhì)的共價結(jié)合，是一種經(jīng)典的化學(xué)修飾方法，可用于對酶的性能改善[8-10]。由于酶表面沒有足夠的PEG連接位點，對酶進(jìn)行PEG修飾時通常需要引入額外的功能化基團(tuán)。酶表面的聚乙二醇涂層不僅可以提高酶在有機(jī)介質(zhì)中的溶解度，而且可以改變酶結(jié)構(gòu)的遷移率和構(gòu)象，從而提高酶的催化性能。并且，由于酶失活通常是因為其疏水位點的暴露，導(dǎo)致其不期望的聚集、變性和失活，聚乙二醇化修飾可以增強(qiáng)酶的親水性，從而減少其疏水位點的暴露，提高酶在反應(yīng)過程中的穩(wěn)定性。固定化酶良好的可重復(fù)利用性對于其工業(yè)應(yīng)用尤為必要，通過開發(fā)可重復(fù)使用的酶催化劑來解決成本問題是經(jīng)濟(jì)可行的工業(yè)過程的重中之重[11]。

在ERD過程中，常用的反應(yīng)模型是脂肪酶催化的合成乙酸正丁酯的酯交換反應(yīng)[12]。本研究引入了南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)與PEG大分子涂層，將大孔吸附樹脂NKA用于固定CALB以制備具有成本優(yōu)勢的固定化酶珠NKA-CALB。然后，NKA-CALB通過葡萄糖-醛基介導(dǎo)的PEG涂層進(jìn)一步強(qiáng)化，得到了經(jīng)過一系列物理化學(xué)修飾后的固定化脂肪酶NKA-CALB-PEG?？疾霳KA-CALB-PEG與商業(yè)固定化脂肪酶Novozyme435的穩(wěn)定性，然后將此固定化脂肪酶用于乙酸乙酯-正丁醇酯交換反應(yīng)，探究NKA-CALB-PEG催化酯交換反應(yīng)的最優(yōu)工藝條件，得出動力學(xué)方程，為模擬計算及ERD工業(yè)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 實 驗

1.1 試劑及材料

CALB，分析純，由丹麥Bagsvaerd Novozyme公司提供；乙酸乙酯(EtAC)和正丁醇(BuOH)均為分析純，購于中國天津市達(dá)茂化學(xué)試劑廠；右旋糖酐(40 000 Da)，由上海笛柏生物科技有限公司提供；高碘酸鈉和硼氫化鈉均為分析純，購于科密歐化學(xué)試劑技術(shù)有限公司；甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2，2 000 Da)，分析純，購于索羅門化學(xué)試劑技術(shù)有限公司；棕櫚酸4-硝基苯酯(pNPP)，分析純，購于天津HEOWNS生物科技有限公司。大孔吸附樹脂NKA，由天津騰盛化學(xué)試劑技術(shù)有限公司提供；聚乙烯亞胺，分析純，購于羅恩化學(xué)試劑技術(shù)有限公司。

1.2 NKA-CALB的制備

將一定量的CALB和10 g NKA加入到容量為1 L的錐形瓶中，并用等體積的pH 為5.0的緩沖液稀釋，然后將錐形瓶置于水浴振蕩器中，在溫度為30 ℃和轉(zhuǎn)速為120 r/min的條件下溫育8 h。用布氏漏斗對制備的產(chǎn)物進(jìn)行純化，并真空干燥4 h，得到固定化脂肪酶命名為NKA-CALB。

采用質(zhì)量濃度為5 g/L的pNPP/乙醇溶液測定干燥后產(chǎn)物的水解活性。通過Bradford方法分析獲得NKA-CALB的蛋白質(zhì)含量[13]。NKA-CALB的水解活性為19 690 U/g，固定效率為82.5%，酶載量為49.5 mg/g。

1.3 NKA-CALB-PEG的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行物理胺化：將2 g聚乙烯亞胺和20 mL磷酸鹽緩沖液(摩爾濃度為25 mmol/L，pH為8.0)的混合物調(diào)節(jié)至pH為8.0后，向混合物中加入1 g NKA-CALB，并在4 ℃下孵育過夜。將混合物真空過濾，并用蒸餾水充分洗滌胺化的NKA-CALB。

采用聚乙二醇涂覆胺化的NKA-CALB：首先將右旋糖酐與高碘酸鈉混合后，在室溫下充分?jǐn)嚢?0 min，充分氧化后用蒸餾水透析得到葡聚糖-醛溶液；將胺化的NKA-CALB添加到此溶液中，并用硼氫化鈉還原；還原的NKA-CALB添加到mPEG-NH2的溶液中進(jìn)行再氧化，最后用蒸餾水徹底洗滌得到固定化脂肪酶NKA-CALB-PEG。通過使用燒結(jié)的玻璃漏斗洗滌并干燥NKA-CALB-PEG，然后用于酶促反應(yīng)。

1.4 NKA-CALB和NKA-CALB-PEG的表征

1.4.1 共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)將NKA-CALB和NKA樹脂分別在質(zhì)量濃度為0.3 g/L的熒光胺/丙酮溶液中室溫下孵育10 min，然后通過離心分離除去過量的熒光胺。通過共聚焦激光顯微鏡檢測純化樣品的熒光信號。采用共聚焦激光掃描顯微鏡評估帶有熒光胺標(biāo)記的NKA和NKA-CALB。熒光胺和蛋白質(zhì)結(jié)合后顯示出熒光特性，可用于表征CALB是否成功固定在NKA樹脂上。

1.4.2 紅外光譜(FT-IR)將NKA-CALB和NKA-CALB-PEG分別按一定比例與溴化鉀混合，制成薄片，然后采用FT-IR光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1。

1.5 酯化活性及穩(wěn)定性

固定化脂肪酶的反應(yīng)活性通過酯化活性來表示，定義為在試驗條件下每小時消耗1 μmol月桂酸的固定化脂肪酶的量。將反應(yīng)前CALB，NKA-CALB，NKA-CALB-PEG，Novozyme435的酯化活性設(shè)定為100%，計算反應(yīng)后CALB，NKA-CALB，NKA-CALB-PEG，Novozyme435的剩余活性。穩(wěn)定性試驗通過考察固定化脂肪酶的剩余活性進(jìn)行評價。

酯化活性試驗：將0.5 mmol月桂酸、2 mmol辛醇，5 mL環(huán)己烷均勻混合，向其中加入10 mg的固定化脂肪酶，在溫度為40 ℃下攪拌2 h。通過熱乙醇法測定月桂酸的剩余量，計算得到固定化脂肪酶的酯化活性。

穩(wěn)定性試驗：采用間歇反應(yīng)器，機(jī)械攪拌，反應(yīng)溫度為70 ℃，分別考察NKA-CALB，NKA-CALB-PEG，Novozyme435在乙酸乙酯與正丁醇酯交換反應(yīng)中的穩(wěn)定性，固定化脂肪酶重復(fù)使用6次，每次反應(yīng)2 h。每次反應(yīng)后通過離心、洗滌和干燥回收固定化脂肪酶，然后進(jìn)行下一次反應(yīng)。

1.6 動力學(xué)試驗

在間歇反應(yīng)釜中進(jìn)行NKA-CALB-PEG催化乙酸乙酯與正丁醇酯交換反應(yīng)的動力學(xué)試驗，考察各反應(yīng)因素對反應(yīng)物轉(zhuǎn)化率的影響，確定最佳的反應(yīng)條件。采用水浴加熱，冷卻水冷凝。間隔1 h進(jìn)行取樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 NKA-CALB和NKA-CALB-PEG的表征

2.1.1 CLSM熒光胺標(biāo)記的NKA和NKA-CALB的CLSM形貌如圖1所示。由圖1可以看出，NKA沒有產(chǎn)生熒光信號，而NKA-CALB卻顯示出明顯的熒光信號，這可以從宏觀上表明CALB被成功吸附在NKA大孔吸附樹脂上。

圖1 熒光胺標(biāo)記的NKA和NKA-CALB的CLSM形貌

2.1.2 FT-IRNKA-CALB和NKA-CALB-PEG的FT-IR譜如圖2所示。由圖2可以看出，波數(shù)1 120 cm-1處對應(yīng)于C—N鍵的拉伸振動吸收峰，NKA-CALB-PEG的峰明顯強(qiáng)于NKA-CALB的峰。甲氧基聚乙二醇胺中的氨基與葡萄糖醛中的醛基反應(yīng)形成席夫堿，該席夫堿進(jìn)一步還原成C—N鍵，證實NKA-CALB已成功地被聚乙二醇化。另外，由于蛋白質(zhì)分子中存在伯胺基，因此在波數(shù)1 647 cm-1處有一個剪切狀的振動吸收峰，具有弱的N—H鍵，表明CALB負(fù)載在NKA樹脂中。

圖2 NKA-CALB 和 NKA-CALB-PEG的FT-IR譜

2.2 穩(wěn)定性試驗

NKA-CALB，NKA-CALB-PEG，Novozyme435在乙酸乙酯與正丁醇酯交換反應(yīng)中的穩(wěn)定性試驗結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，與Novozyme435和NKA-CALB相比，NKA-CALB-PEG顯示出最好的操作穩(wěn)定性。在重復(fù)使用6次之后，Novozyme435的剩余活性為60.2%，NKA-CALB的剩余活性為78.6%，而NKA-CALB-PEG在重復(fù)使用6次后可以有效地將其剩余活性保持在92.4%，表明制備的NKA-CALB-PEG具備良好的穩(wěn)定性，能夠適應(yīng)嚴(yán)峻的工業(yè)生產(chǎn)條件，同時其可重復(fù)利用度高，具有極大的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。

圖3 NKA-CALB，NKA-CALB-PEG，Novozyme435的穩(wěn)定性試驗結(jié)果■—NKA-CALB； ■—NKA-CALB-PEG； ■—Novozyme435

2.3 反應(yīng)動力學(xué)試驗

2.3.1 攪拌速率的影響攪拌速率對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響如圖4所示。由圖4可以看出，在反應(yīng)時間相同的條件下，攪拌速率從200 r/min升至300 r/min時，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率明顯提高；當(dāng)攪拌速率從300 r/min 升至400 r/min時，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率提高幅度較小，因此可認(rèn)為當(dāng)攪拌速率大于300 r/min 時，外擴(kuò)散作用已經(jīng)消除，若繼續(xù)增大轉(zhuǎn)速，會對設(shè)備及催化劑帶來較大磨損，同時耗能也大，因此綜合考慮選定攪拌速率為300 r/min。

2.3.2 催化劑用量的影響催化劑的用量對反應(yīng)的影響較大，用量過少會使反應(yīng)速率減小，導(dǎo)致反應(yīng)時間增長，催化劑過量又會造成資源浪費(fèi)。催化劑用量以其與乙酸乙酯的質(zhì)量比計，分別選取5%，10%，15%。催化劑用量對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響如圖5所示。由圖5可以看出：在反應(yīng)時間相同的條件下，催化劑用量由5%增至10%時，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率增加明顯；繼續(xù)增加催化劑用量至15%時，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率并未有明顯提升。因此催化劑用量選定為10%。

圖4 攪拌速率對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響攪拌速率，r/min： ■—200； ●—300； ▲—400

圖5 催化劑用量對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響■—5%; ●—10%; ▲—15%

2.3.3 乙酸乙酯和正丁醇摩爾比的影響分別考察正丁醇過量和乙酸乙酯過量對反應(yīng)物轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，在相同的乙酸乙酯和正丁醇摩爾比條件下，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率或正丁醇轉(zhuǎn)化率都是在反應(yīng)進(jìn)行到7 h時不再呈現(xiàn)上升趨勢，即認(rèn)為達(dá)到反應(yīng)平衡。由圖6(a)可知，在反應(yīng)時間相同的條件下，隨著反應(yīng)物中正丁醇占比的增加，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率總體呈現(xiàn)下降趨勢。由圖6(b)可知，在反應(yīng)時間相同的條件下，反應(yīng)進(jìn)行到3 h后，正丁醇轉(zhuǎn)化率隨著乙酸乙酯加入量的增加才呈現(xiàn)下降趨勢。綜上所述，不論正丁醇過量或是乙酸乙酯過量，對固定化脂肪酶催化酯交換反應(yīng)均產(chǎn)生了抑制作用。因此，選取乙酸乙酯與正丁醇摩爾比為1∶1時反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率最大。

2.3.4 反應(yīng)溫度的影響反應(yīng)溫度對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響如圖7所示。由圖7可以看出，在反應(yīng)時間相同的條件下，反應(yīng)溫度為65 ℃時，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率最高，為77.1%。在超過65 ℃時轉(zhuǎn)化率反而降低，是因為固定化脂肪酶在65 ℃下酯化活性最高，超過此溫度酶的酯化活性會下降。對可逆反應(yīng)來說，溫度對反應(yīng)速率的影響是最大的，升高溫度有利于加快反應(yīng)速率，但是固定化脂肪酶長時間在高溫條件下酯化活性容易受損。因此，選擇65 ℃為反應(yīng)的最適宜溫度。

正丁醇/乙酸乙酯摩爾比： ■—1∶1; ●—1.25∶1; ▲—1.5∶1

乙酸乙酯/正丁醇摩爾比： ■—1∶1； ●—1.5∶1； ▲—2∶1圖6 乙酸乙酯和正丁醇摩爾比對反應(yīng)物轉(zhuǎn)化率的影響

圖7 反應(yīng)溫度對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響■—60 ℃; ●—65 ℃; ▲—70 ℃;

2.4 化學(xué)平衡常數(shù)的測定

化學(xué)平衡常數(shù)(K)可由平衡時混合物的組成得到，K由達(dá)到平衡時的混合物的活度表示，活度系數(shù)(α)由Wilson方程計算得到。K的計算公式見式(1)。

(1)

由反應(yīng)溫度為333.15，338.15，343.15，348.15 K下得到的反應(yīng)數(shù)據(jù)，求得相應(yīng)平衡常數(shù)K分別為0.145 4，0.169 9，0.208 3，0.239 3。平衡常數(shù)與反應(yīng)溫度(T)的關(guān)系曲線如圖8所示。

圖8 平衡常數(shù)與反應(yīng)溫度的關(guān)系曲線

擬合出平衡常數(shù)與溫度的關(guān)系,如式(2)所示。

(2)

式中,T為反應(yīng)溫度，K。

根據(jù)圖8和Van’t Hoff方程計算反應(yīng)焓變，可得標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)焓變(ΔH)為32.74 kJ/mol，證明該反應(yīng)為吸熱反應(yīng)。

2.5 動力學(xué)方程的擬合

乙酸乙酯與正丁醇酯交換反應(yīng)為可逆二級反應(yīng)[15]，反應(yīng)速率如式(3)所示。

r=k+c(EtAC)c(BuOH)-k-c(BuAC)c(EtOH)

=k+[c(EtAC)c(BuOH)-c(BuAC)c(EtOH)/K]

(3)

式中：r為反應(yīng)速率，mol/(L·min)；k為反應(yīng)速率常數(shù)，L·mol/min；c為濃度，mol/L；下標(biāo)+、-分別表示正、逆反應(yīng)方向。

根據(jù)化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)模型，將試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸擬合，如圖9所示。由圖9也可以看出，酯交換反應(yīng)為吸熱反應(yīng)。

圖9 反應(yīng)速率常數(shù)與溫度的關(guān)系

由此得到該酯交換反應(yīng)的Arrhenius方程為：

(4)

(5)

根據(jù)Arrhenius 方程線性回歸擬合得到相應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)，k+和k-分別為495.625 L·mol/min和0.025 L·mol/min，對應(yīng)的反應(yīng)活化能Ea+和Ea-分別為4.603×104kJ/mol和7.860×103kJ/mol。最終得到乙酸乙酯和正丁醇反應(yīng)的動力學(xué)方程為：

(6)

其中

(7)

式中，R為氣體常數(shù)，J/(mol·K)。

3 結(jié) 論

(1) 通過聚合物涂層修飾固定化脂肪酶的策略制備新型固定化脂肪酶NKA-CALB-PEG，其重復(fù)使用6次后剩余活性為92.4%，與Novozyme435和NKA-CALB相比，NKA-CALB-PEG具有更好的穩(wěn)定性。

(2) 通過乙酸乙酯和正丁醇酯交換反應(yīng)動力學(xué)試驗確定的最優(yōu)工藝條件為：攪拌速率300 r/min、催化劑用量10%、反應(yīng)溫度65 ℃、乙酸乙酯/正丁醇摩爾比1∶1。

(3) 建立動力學(xué)模型，將動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到乙酸乙酯與正丁醇酯交換反應(yīng)的動力學(xué)方程。比較試驗值和計算值，結(jié)果表明此宏觀動力學(xué)方程具備合理性，為該工藝進(jìn)一步工業(yè)化提供了重要數(shù)據(jù)支撐。