魏思潔，馬馨月，張 超，柯 檀，張渝蕊，陳蘭洲

(武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079)

隨著我國(guó)工業(yè)化的快速發(fā)展，大量污染物被釋放后進(jìn)入水體，在污染水環(huán)境的同時(shí)，也對(duì)人類(lèi)健康和生存造成嚴(yán)重的影響[1]。為了控制廢水污染物對(duì)水環(huán)境造成的危害，我國(guó)規(guī)定了廢水中污染物的理化指標(biāo)，如化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、總磷(TP)等的標(biāo)準(zhǔn)限值[2]。但即使廢水中污染物的理化指標(biāo)達(dá)標(biāo)，廢水中污染物仍會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生一系列毒性效應(yīng)，最終可能會(huì)威脅水生態(tài)系統(tǒng)的平衡[2]。因此，除了根據(jù)污染物理化指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)廢水排放對(duì)水環(huán)境的危害外，還應(yīng)針對(duì)廢水中污染物對(duì)水生生物的綜合毒性效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到對(duì)水環(huán)境進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的目的。

我國(guó)水體重金屬污染問(wèn)題十分突出[3]，江河湖庫(kù)底質(zhì)的重金屬污染率相當(dāng)高，并且隨河流攜帶入海的重金屬污染物總量巨大，這些重金屬污染物可能會(huì)對(duì)整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)造成負(fù)面影響[4]。藻類(lèi)作為水體中的初級(jí)生產(chǎn)者在水生態(tài)系統(tǒng)中具有十分重要的作用，同時(shí)藻類(lèi)由于個(gè)體小、繁殖快、易于培養(yǎng)且對(duì)污染物敏感，被廣泛應(yīng)用于廢水監(jiān)測(cè)[5]。重金屬污染物如Cr6+、Pb2+和Ni2+進(jìn)入水體后，可對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制、生理代謝混亂等毒性效應(yīng)[6]。萊茵衣藻作為模式生物與許多高等動(dòng)植物在某些基因和生理機(jī)制上具有同源性，利用萊茵衣藻開(kāi)展重金屬的水環(huán)境生物效應(yīng)研究具有重要的意義[7]。因此，本研究以萊茵衣藻為受試生物，利用快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析和毒理測(cè)試方法，開(kāi)展3種典型重金屬(Cr6+、Pb2+和Ni2+)對(duì)萊茵衣藻的單一毒性效應(yīng)試驗(yàn)，分析萊茵衣藻的光合活性和抗氧化系統(tǒng)對(duì)不同種類(lèi)和不同濃度重金屬毒性效應(yīng)的響應(yīng)情況，以為萊茵衣藻作為指示生物應(yīng)用于重金屬污染水體監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻種來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻類(lèi)藻種庫(kù)(FACHB)。無(wú)菌操作下將藻種轉(zhuǎn)接至新鮮滅菌過(guò)的SE(Selenite Enrichment)培養(yǎng)基中，于光照培養(yǎng)箱中以恒溫20℃±1℃、光強(qiáng)50 μE/(m2·s)、12 h∶12 h明暗交替光照周期條件下，通氣培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重金屬處理萊茵衣藻的方法

取100 mL SE培養(yǎng)基置于若干個(gè)錐形瓶中，向錐形瓶中分別加入不同體積的K2Cr2O7母液(1 g/L)，使Cr6+的最終濃度分別為0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L；另在錐形瓶中分別加入不同體積的Pb(NO3)2母液(1 g/L)，使Pb2+的最終濃度分別為0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L；另在錐形瓶中分別加入不同體積的Ni(NO3)2母液(5 g/L)，使Ni2+的最終濃度分別為0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L。將含有重金屬污染物的培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌，備用。取100 mL培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的萊茵衣藻，離心收集藻體，再經(jīng)無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移至上述含不同濃度重金屬污染物的培養(yǎng)基中，混勻后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)不同的處理時(shí)間后取樣測(cè)定藻液的參數(shù)，每組樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定方法

取2 mL經(jīng)重金屬處理后的藻液，避光放置15 min后，采用便攜式植物效率分析儀(PEA，Hanasatech?，U.K.)于室溫、遮光條件下測(cè)定萊茵衣藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)，激發(fā)光強(qiáng)為最大光強(qiáng)的50%[約為1 500 μE/(m2·s)]，記錄時(shí)間為5 s。利用測(cè)得的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，經(jīng)過(guò)處理后可繪制葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，并可計(jì)算得到其他關(guān)于萊茵衣藻光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的光合參數(shù)，包括最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、單位面積內(nèi)反應(yīng)中心數(shù)量(RC/CS0)、照光2 ms時(shí)有活性的反應(yīng)中心的開(kāi)放程度(ET0/TR0)和反應(yīng)中心吸收的光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(ET0/ABS)[8]。

1.2.3 葉綠素a含量的測(cè)定方法

藻液中葉綠素a含量的測(cè)定采用乙醇-分光光度法[8]。取5 mL經(jīng)重金屬處理后的藻液，離心(8 000 r/min，10 min，4℃)后棄去上清液，收集藻體；然后加入5 mL 95%乙醇，搖勻置于4℃冰箱24 h后，再次離心(8 000 r/min，10 min，4℃)，取上清液測(cè)定665 nm和649 nm處的吸光度值，并通過(guò)以下公式計(jì)算得到藻液中葉綠素a含量：

葉綠素a含量=13.95×OD665-6.88×OD649

(1)

式中：葉綠素a含量為藻液中葉綠素a含量(mg/L)；OD665和OD649分別為665 nm和649 nm處的吸光度值。

1.2.4 藻類(lèi)丙二醛(MDA)含量的測(cè)定方法

取5 mL經(jīng)重金屬處理后的藻液，離心(8 000 r/min，10 min，4℃)后收集藻體，用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.8)洗滌3次；然后加入5 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.8)，冰浴超聲破碎后離心(8 000 r/min，10 min，4℃)，得到的上清液即為粗酶提取液。

藻類(lèi)丙二醛(MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[9]。取1 mL粗酶提取液，加入2 mL 10%三氯乙酸、2 mL 0.6%硫代巴比妥酸，混合均勻后置于100℃水浴20 min；然后冷卻至室溫后，測(cè)定其在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度值，并通過(guò)以下公式計(jì)算藻液中MDA含量(最終結(jié)果以單位葉綠素a的MDA含量表示)：

MDA=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(2)

式中:MDA為藻液中MDA含量(mmol/mg)；OD532、OD600和OD450分別為532 nm、600 nm和450 nm處的吸光度值。

1.2.5 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法

藻液中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[9]。取0.1 g考馬斯亮藍(lán)(G-250)溶于50 mL 95%乙醇中，混勻后加入100 mL 85%濃磷酸，用蒸餾水定容至1 000 mL；然后取1 mL粗酶提取液加入5 mL G-250試劑并混勻，5 min后測(cè)定其在595 nm處的吸光度值，再根據(jù)可溶性蛋白質(zhì)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算藻液中可溶性蛋白質(zhì)含量。本次試驗(yàn)使用結(jié)晶牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定方法

藻液中超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法[9]。向樣品管中加入1 mL粗酶提取液，向?qū)φ展苤屑尤? mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.8)；然后分別加入3.1 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，含100 μmol/L EDTA-Na2)、0.3 mL甲硫氨酸溶液(220 mmol/L)、0.3 mL氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液(1.25 mmol/L)和0.3 mL核黃素溶液(33 μmol/L)，混勻后，取其中一組對(duì)照管于避光條件下反應(yīng)，另一組對(duì)照管和樣品管于4 000 Lux日光燈下反應(yīng)，20 min后測(cè)定對(duì)照管和樣品管中反應(yīng)液在560 nm處的吸光度值，通過(guò)以下公式計(jì)算酶活：

SOD=2×(ODCK-OD560)/ODCK

(3)

式中:SOD為超氧化物歧化酶活性(U/mg)；ODCK和OD560分別為對(duì)照管和樣品管中反應(yīng)液在560 nm處的吸光度值。

1.2.7 重金屬對(duì)萊茵衣藻的毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)方法

藻液經(jīng)重金屬處理72 h后，以重金屬濃度的對(duì)數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo)，以重金屬對(duì)萊茵衣藻的3項(xiàng)毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)(Fv/Fm、MDA含量、SOD活性)的相對(duì)抑制率為縱坐標(biāo)，分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性擬合，再根據(jù)各個(gè)毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的線(xiàn)性擬合優(yōu)度(R2)和半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)值為標(biāo)準(zhǔn)，選取最敏感的毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行后續(xù)評(píng)價(jià)。毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的相對(duì)抑制率計(jì)算公式如下：

相對(duì)抑制率(%)=(S0-Sm)/S0×100%

(4)

式中:S0為對(duì)照組的毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)值，Sm為樣品組的毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析方法

本文利用Origin軟件中的線(xiàn)性擬合功能得到毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)相對(duì)抑制率對(duì)重金屬濃度對(duì)數(shù)值的擬合直線(xiàn)及相關(guān)擬合參數(shù)，再利用SPSS軟件中單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncant法進(jìn)行3項(xiàng)毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的差異性分析(p<0.05)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 重金屬脅迫對(duì)萊茵衣藻葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的影響

不同重金屬濃度和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻葉綠素a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的對(duì)比，見(jiàn)圖1。O相、J相、I相和P相熒光值分別為暴露時(shí)間50 μs、2 ms、30 ms和葉綠素a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)最高峰處的熒光強(qiáng)度[10]。

由圖1可見(jiàn)，經(jīng)重金屬處理24 h后，萊茵衣藻葉綠素a熒光強(qiáng)度隨重金屬濃度的增加逐漸下降，此時(shí)J相、P相熒光值雖然強(qiáng)度減弱但仍可被觀(guān)察到；經(jīng)重金屬處理72 h后，在部分高濃度重金屬脅迫下P相熒光值隨著處理時(shí)間的增加，其強(qiáng)度越來(lái)越弱，萊茵衣藻葉綠素a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)幾乎為平直狀態(tài)；在整個(gè)處理過(guò)程中，Cr6+和Pb2+處理組葉綠素a熒光強(qiáng)度比Ni2+處理組下降得更迅速且下降幅度更大。

2.2 重金屬脅迫對(duì)萊茵衣藻光合參數(shù)的影響

不同重金屬濃度和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻光合參數(shù)變化的對(duì)比，見(jiàn)表1和圖2。

由表1和圖2可知，在加入重金屬后，隨著時(shí)間的推移和重金屬濃度的增加，萊茵衣藻的光合參數(shù)Fv/Fm、RC/CS0、ET0/TR0和ET0/ABS顯著下降且下降幅度越來(lái)越大，高濃度重金屬處理組的部分光合參數(shù)值接近于0，表明高濃度重金屬明顯抑制了萊茵衣藻的光合參數(shù)，但隨著Ni2+濃度的增加，萊茵衣藻的光合參數(shù)ET0/TR0和ET0/ABS的變化并不顯著。

2.3 重金屬脅迫對(duì)萊茵衣藻MDA含量的影響

不同濃度重金屬和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻MDA含量變化的對(duì)比，見(jiàn)圖3。

圖1 不同重金屬濃度和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻葉綠素a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的對(duì)比Fig.1 Comparison of chlorophyll fluorescence induction kinetics curves of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period注：CK代表無(wú)重金屬脅迫的對(duì)照組。下同。

表1 不同重金屬濃度和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻光合參數(shù)變化的對(duì)比Table 1 Comparison of photosynthetic parameter changes of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time periods

續(xù)表1

光合參數(shù)處理時(shí)間/d不同濃度Pb2+處理0(CK)2mg/L4mg/L6mg/L8mg/L10mg/L10.343±0.003a0.337±0.002b0.335±0.002b0.302±0.003c0.275±0.002d0.233±0.002eET0/TR020.321±0.003a0.315±0.003b0.216±0.002c0.220±0.002c0.197±0.002d0.158±0.002e30.321±0.002a0.222±0.002b0.193±0.002c0.118±0.002d0.056±0.002e0.000±0.001f1329.66±35.59a325.56±26.67a302.12±30.34ab294.24±28.97ab283.24±28.28ab264.06±28.97bRC/CS02325.42±25.28a275.33±10.19b211.45±9.55c155.98±7.49d103.58±11.87e80.98±3.13e3307.21±29.99a164.62±12.83b123.59±15.97c92.83±7.17d65.88±5.41de39.62±6.76e光合參數(shù)處理時(shí)間/d不同濃度Ni2+處理0(CK)5mg/L10mg/L15mg/L20mg/L25mg/L10.264±0.0340.261±0.0280.260±0.0190.261±0.0220.249±0.0140.252±0.014ET0/ABS20.256±0.0480.256±0.0350.258±0.0350.262±0.0250.251±0.0260.257±0.02230.258±0.0270.248±0.0250.247±0.0240.232±0.0220.226±0.0100.221±0.01410.367±0.0360.368±0.0320.368±0.0340.367±0.0320.361±0.0330.362±0.028ET0/TR020.361±0.0390.360±0.0380.366±0.0380.372±0.0310.367±0.0400.369±0.03230.357±0.0390.354±0.0400.353±0.0310.323±0.0340.347±0.0310.359±0.0321552.16±36.07a534.85±21.51a503.75±39.16ab494.80±38.08ab487.86±40.14ab453.99±44.30bRC/CS02549.48±26.80a482.15±10.14b428.30±44.40bc394.78±29.30cd356.35±36.61d399.40±48.91cd3549.74±41.36a352.92±11.51b300.23±24.94c268.69±41.95c149.33±15.97d147.79±11.87d

注：a、b、c、d、e、f表示使用單因素方差分析中的Duncant法得出的不同數(shù)據(jù)之間差異的顯著性(p<0.05)。下同。

圖2 不同濃度重金屬和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)變化的對(duì)比Fig.2 Comparison of changes of maximum quantum yield of PS II photochemistry (Fv/Fm) of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period

圖3 不同濃度重金屬和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻MDA含量變化的對(duì)比Fig.3 Comparison of changes of MDA content of C.reinhardtii processed by different concentration of heavy metals in various time period

MDA是由膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生的，其含量的高低反映了細(xì)胞膜被氧化的程度，也在一定程度上反映了細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平[11]。由圖3可見(jiàn)，經(jīng)Pb2+和Ni2+處理2 d后，萊茵衣藻中MDA含量增加并不明顯，甚至有部分處理組萊茵衣藻中MDA含量下降，但Cr6+脅迫下萊茵衣藻中MDA含量顯著增加；經(jīng)不同重金屬處理3 d后，萊茵衣藻中MDA含量均上升，其中Ni2+處理組萊茵衣藻中MDA含量上升不明顯，而Cr6+和Pb2+處理組上升顯著且呈梯度上升。

2.4 重金屬脅迫對(duì)萊茵衣藻SOD活性的影響

不同濃度重金屬和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻SOD活性變化的對(duì)比，見(jiàn)圖4。

SOD是一種清除生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的酶，它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，減少自由基對(duì)生物體的損害[12]。由圖4可見(jiàn)，經(jīng)Cr6+和Pb2+處理1 d后，部分處理組萊茵衣藻中SOD活性增強(qiáng)，但Ni2+處理組SOD活性一直降低；經(jīng)不同重金屬處理3 d后，萊茵衣藻中SOD活性均顯著降低，且重金屬濃度越大，萊茵衣藻中SOD活性降低速度越快。

圖4 不同濃度重金屬和不同時(shí)間處理?xiàng)l件下萊茵衣藻SOD活性變化的對(duì)比Fig.4 Comparison of changes of SOD activity of C.reinhardtii processed by different concentrations of heavy metals in various time period

2.5 重金屬脅迫對(duì)萊茵衣藻的毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)

不同重金屬對(duì)萊茵衣藻3項(xiàng)毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的相對(duì)抑制率與重金屬濃度的線(xiàn)性擬合優(yōu)度對(duì)比，見(jiàn)圖5。

圖5 不同重金屬脅迫下萊茵衣藻3項(xiàng)毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的相對(duì)抑制率與重金屬濃度的線(xiàn)性擬合優(yōu)度對(duì)比Fig.5 Comparison of linear goodness of fit of relative inhibition rates among three toxicity evaluation indexes of heavy metals to C.reinhardtii with heavy metal concentrations注：lgC為重金屬濃度的對(duì)數(shù)值

由圖5可見(jiàn)，不同重金屬對(duì)萊茵衣藻3項(xiàng)毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的相對(duì)抑制率與重金屬濃度的線(xiàn)性擬合優(yōu)度R2值排序均為Fv/Fm>SOD活性>MDA含量，即萊茵衣藻光合參數(shù)Fv/Fm的擬合優(yōu)度最佳。

通過(guò)比較不同重金屬脅迫下萊茵衣藻3項(xiàng)毒性指標(biāo)的EC50值(見(jiàn)表2)可知：各重金屬對(duì)萊茵衣藻毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)中Fv/Fm的EC50值最小，結(jié)合圖5結(jié)果可知，3項(xiàng)毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)中，F(xiàn)v/Fm對(duì)重金屬的毒性響應(yīng)最為敏感，表明萊茵衣藻光合參數(shù)Fv/Fm是表征重金屬對(duì)萊茵衣藻毒性效應(yīng)的最佳參數(shù)。

表2 不同重金屬脅迫下萊茵衣藻3項(xiàng)毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的EC50值Table 2 EC50 values of three toxicity evaluation indexes of C.reinhardtii under the stress of different heavy metals

重金屬對(duì)萊茵衣藻毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)的相對(duì)抑制率達(dá)到50%時(shí)所需的重金屬濃度越低，說(shuō)明該重金屬對(duì)萊茵衣藻的毒性效應(yīng)越強(qiáng)。由表2可知，3種重金屬對(duì)萊茵衣藻的毒性效應(yīng)強(qiáng)度排序?yàn)镃r6+>Pb2+>Ni2+，表明萊茵衣藻對(duì)3種重金屬的毒性效應(yīng)響應(yīng)程度存在一定的差異。

3 討論與分析

當(dāng)藻細(xì)胞受到外界污染物刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，若未被及時(shí)清除就會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化、酶失活等損傷，導(dǎo)致藻細(xì)胞活性降低[18]。部分Pb2+和Ni2+處理組萊茵衣藻中MDA含量在24 h內(nèi)有所降低(見(jiàn)圖3)，可能是因?yàn)閮?nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)可以清除或修復(fù)受損的生物分子，SOD成功地清除了ROS，減少了MDA的生成，從而保持了細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)的完整性[19]。Cr6+和Pb2+處理組24 h后萊茵衣藻中SOD活性有所上升(見(jiàn)圖4)，可能原因是藻細(xì)胞在短期內(nèi)迅速做出反應(yīng)，啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制，SOD合成增加以保持自由基平衡[20]；但Cr6+處理組萊茵衣藻中MDA含量沒(méi)有降低，可能是由于萊茵衣藻對(duì)Cr6+的毒害最敏感，產(chǎn)生的MDA含量遠(yuǎn)大于MDA被清除的含量。隨著處理時(shí)間的增加，重金屬處理3 d后萊茵衣藻中SOD活性顯著降低，且重金屬濃度越大，其SOD活性降低速度越快，可能是由于藻細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制仍無(wú)法完全消除ROS，導(dǎo)致藻細(xì)胞受到ROS的損傷隨著時(shí)間的推移加劇，使得DNA本身或其轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到影響，且SOD結(jié)構(gòu)被破壞后補(bǔ)充量不足，導(dǎo)致后期萊茵衣藻中SOD活性降低。3種重金屬處理72 h后，萊茵衣藻中MDA含量增加和SOD活性降低，說(shuō)明3種重金屬最終都會(huì)對(duì)萊茵衣藻造成一定的氧化損傷，但萊茵衣藻對(duì)Ni2+有一定的耐受性，而對(duì)Cr6+比較敏感，故在短期內(nèi)Cr6+就對(duì)萊茵衣藻造成了較強(qiáng)的氧化損傷。

Fv/Fm參數(shù)可由快速葉綠素a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析方法直接測(cè)得，不需要經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)的輸出和計(jì)算過(guò)程，因此適合作為4種光合參數(shù)的代表。同時(shí)，快速葉綠素a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析作為毒性評(píng)價(jià)的探針，具有操作簡(jiǎn)便、快速有效且攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，在污染物的環(huán)境監(jiān)測(cè)中具有重要意義[21]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖5和表2)，選取Fv/Fm參數(shù)作為后續(xù)評(píng)價(jià)重金屬對(duì)萊茵衣藻毒性效應(yīng)的指標(biāo)。根據(jù)不同重金屬脅迫下萊茵衣藻的光合參數(shù)Fv/Fm的EC50值，得到不同重金屬對(duì)萊茵衣藻的毒性強(qiáng)度排序?yàn)椋篊r6+>Pb2+>Ni2+。Cr6+對(duì)萊茵衣藻的毒性效應(yīng)最強(qiáng)，其原因可能是因?yàn)镃r6+具有強(qiáng)氧化性，可迅速對(duì)藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)和DNA造成損傷[22]，并且萊茵衣藻的自身結(jié)構(gòu)可能對(duì)Cr6+的脅迫更加敏感。

4 結(jié)論與展望

以萊茵衣藻為受試生物，利用快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析和毒理測(cè)試方法，開(kāi)展3種典型重金屬(Cr6+、Pb2+和Ni2+)對(duì)萊茵衣藻的單一毒性效應(yīng)試驗(yàn)，分析不同種類(lèi)和不同濃度重金屬對(duì)萊茵衣藻的光合性和抗氧化系統(tǒng)的影響，得到如下結(jié)論：

(1) 重金屬Cr6+、Pb2+和Ni2+對(duì)萊茵衣藻的單一脅迫作用均能對(duì)其生理過(guò)程產(chǎn)生一定的毒害影響：3種重金屬均可降低藻細(xì)胞的光合活性，增加膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度，抑制抗氧化酶活性，進(jìn)而破壞藻細(xì)胞的整體穩(wěn)態(tài)，影響其正常生長(zhǎng)。

(2) 萊茵衣藻對(duì)不同種類(lèi)和不同濃度的重金屬毒性效應(yīng)響應(yīng)程度不同，三種重金屬對(duì)萊茵衣藻的毒性效應(yīng)大小排序?yàn)椋篊r6+>Pb2+>Ni2+，即萊茵衣藻對(duì)Cr6+脅迫最敏感。另外，在3種重金屬對(duì)萊茵衣藻的單一毒性效應(yīng)試驗(yàn)中，毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)Fv/Fm對(duì)重金屬毒性效應(yīng)的響應(yīng)最為敏感，說(shuō)明利用快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析能夠快速、高效地檢測(cè)出不同重金屬對(duì)藻類(lèi)毒性效應(yīng)的強(qiáng)度。

本文研究結(jié)果表明，萊茵衣藻和快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析在重金屬污染廢水監(jiān)測(cè)中有較大的應(yīng)用價(jià)值。但在實(shí)際廢水環(huán)境中，重金屬通常以共存的形式出現(xiàn)，并且其相互作用會(huì)對(duì)生物體造成不同的未知生理效應(yīng)。因此，下一步的研究工作還需考察廢水中共存重金屬對(duì)萊茵衣藻的脅迫作用，以使萊茵衣藻在重金屬?gòu)U水監(jiān)測(cè)中發(fā)揮更大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。