王苗苗，強(qiáng)瀝文*，王 偉，張克強(qiáng)，孫斌斌

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；2.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300071）

二氧化鈦納米顆粒（TiO2NPs）具有納米尺度效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)、光催化效應(yīng)以及吸收紫外線能力強(qiáng)等特點，其被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，預(yù)計到2025年，TiO2NPs年產(chǎn)量將達(dá)到2.5×106t[1-4]。TiO2NPs的高產(chǎn)量和廣泛應(yīng)用，將使其不可避免地通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境。在中國、瑞士和美國等地區(qū)均檢測到TiO2NPs的存在，環(huán)境濃度可達(dá)每升幾百微克[5-7]。目前，關(guān)于TiO2NPs生物毒性的研究已取得一定進(jìn)展，但多限于單一TiO2NPs在實驗室條件下的毒性作用。已證實TiO2NPs對微生物、藻類、植物、無脊椎動物、哺乳動物以及魚類均會產(chǎn)生毒性效應(yīng)[8]。但TiO2NPs對農(nóng)作物的毒性研究較少。Asli等[9]研究表明，TiO2NPs降低了玉米根系運輸水分和營養(yǎng)的能力，抑制了葉片的蒸騰作用和生長。TiO2NPs處理的豌豆和玉米，發(fā)芽延遲、根長變短[10]。TiO2NPs還可以誘導(dǎo)活性氧（ROS）產(chǎn)生，引起氧化脅迫，導(dǎo)致植物的基因毒性和DNA損傷[11-12]。也有研究表明TiO2NPs促進(jìn)了菠菜的光合作用[13]。

實際環(huán)境中，TiO2NPs通常與傳統(tǒng)污染物共存并發(fā)生相互作用。TiO2NPs相對于宏觀顆粒物具有更大的比表面積、特殊的表面化學(xué)性質(zhì)以及團(tuán)聚微孔結(jié)構(gòu)等特性[14]，并且TiO2NPs常作為吸附劑來處理水環(huán)境中的傳統(tǒng)污染物，如重金屬、有機(jī)污染物，因此當(dāng)TiO2NPs在環(huán)境中與污染物共存時，很可能成為污染物的載體[15]。一方面可能會使環(huán)境中污染物濃度降低，達(dá)到“消減”的效果，但另一方面也可能導(dǎo)致污染物在納米材料上“富集”，從而改變自身及環(huán)境中傳統(tǒng)污染物的遷移轉(zhuǎn)化行為，影響污染物在生物體內(nèi)的生物有效性和毒性效應(yīng)[16-17]。鎘（Cd）因其移動性強(qiáng)、毒性高等特點成為我國農(nóng)田環(huán)境中污染最嚴(yán)重的重金屬[18]。TiO2NPs可通過大氣沉降、污水灌溉、廢棄物填埋、地表徑流、污泥農(nóng)用、施肥、納米產(chǎn)品使用等途徑進(jìn)入農(nóng)田環(huán)境[19]。TiO2NPs的使用和廢棄量逐年增加，進(jìn)入我國農(nóng)業(yè)環(huán)境中的TiO2NPs將越來越多，使環(huán)境中TiO2NPs和重金屬共存的可能性增大。因此，以TiO2NPs為典型代表的納米材料將影響重金屬Cd在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)。

重金屬和納米材料相互作用的研究尚處于起步階段。TiO2NPs對Cd生物毒性影響的研究十分有限，且受試生物多為藻類、大型蚤和雙殼類動物。研究表明，TiO2NPs可降低水體中自由態(tài)Cd，抑制Cd對藻類的生物有效性和毒性[20-21]。TiO2NPs可增加Cd攝入量，進(jìn)而顯著增強(qiáng)其對大型蚤的生物毒性[22-23]。然而，在海洋和淡水雙殼類生物體內(nèi)，TiO2NPs對Cd的富集及毒性效應(yīng)影響并不顯著[24-25]。Yang等[15]以四膜蟲為研究對象，發(fā)現(xiàn)TiO2NPs可攜帶Cd直接進(jìn)入四膜蟲細(xì)胞內(nèi)；在魚體內(nèi)TiO2NPs可顯著促進(jìn)Cd的生物富集量[26]，但會抑制Cd的基因毒性[27]。目前，關(guān)于TiO2NPs對植物尤其是農(nóng)作物吸收積累Cd的研究較少。有限的研究表明，在蘿卜中TiO2NPs對Cd的植物毒性沒有顯著影響[28]；而在大豆中TiO2NPs增加了Cd的吸收量，但降低了Cd的脅迫[29]。近期有學(xué)者通過水培的方式發(fā)現(xiàn)TiO2NPs降低了水稻苗中Cd的毒性，但植株體內(nèi)的Ti含量顯著增加[30]。這些研究表明TiO2NPs在不同農(nóng)作物體內(nèi)的生物效應(yīng)不同，不同的作物培養(yǎng)方式也可能會使研究結(jié)果產(chǎn)生差異。因此，研究農(nóng)作物中納米顆粒和共存重金屬的復(fù)合生物效應(yīng)對維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)和食品安全具有重要意義。

小白菜作為世界上廣泛食用和種植的綠葉蔬菜之一，具有更易從土壤中吸收Cd并轉(zhuǎn)移到可食部位的能力[31]。目前，關(guān)于TiO2NPs存在下Cd對小白菜毒性效應(yīng)變化的影響還未見報道。因此，本文研究了TiO2NPs存在下Cd對小白菜葉綠素、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、生物富集及超微結(jié)構(gòu)的影響，以探討TiO2NPs對Cd脅迫下小白菜毒性效應(yīng)影響機(jī)制。研究結(jié)果將為更全面地評估納米顆粒的潛在環(huán)境風(fēng)險提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 TiO2 NPs懸浮液分散行為分析

供試TiO2NPs（純度＞99.0%）購自北京伊諾凱科技有限公司，JEM-200CX透射電鏡（TEM）觀察顯示，TiO2NPs為銳鈦礦型，粒徑約為30 nm（圖1）。TiO2NPs儲備液每次實驗前現(xiàn)配現(xiàn)用。為避免團(tuán)聚，保證混合均勻，實驗前冰浴超聲（600 W、40 kHz）40 min，慢速磁力攪拌2 h（150 r·min-1），以保證充分分散。采用Hoagland營養(yǎng)液將其配制成實驗濃度的TiO2NPs懸浮液以及TiO2NPs與Cd的混合溶液，Hoagland營養(yǎng)液配方[32]：Ca（NO3）2·4H2O 945 mg·L-1，KNO3607 mg·L-1，NH4H2PO4115 mg·L-1，MgSO4·7H2O 493 mg·L-1，H3BO32.86 mg· L-1，MnCl2· 4H2O 1.81 mg· L-1，ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.08 mg·L-1，（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.02 mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.85 mg·L-1，Na2-EDTA 37.25 mg·L-1。

采用動態(tài)光散射（DLS）分析方法，用馬爾文激光粒度儀ZS90測定TiO2NPs的水合粒徑（Dh）、聚合物多分散性指數(shù)（PDI）和Zeta電位。

1.2 小白菜幼苗培養(yǎng)與處理

圖1 TiO2 NPs透射電鏡圖（A×10 000倍）和晶型表征（B）Figure 1 TEM image（A×10 000 times）and XRDcrystal form（B）of TiO2 NPs

選取籽粒飽滿的小白菜種子，用5%的次氯酸鈉（NaClO）進(jìn)行表面消毒10 min，去離子水清洗后放置于恒溫培養(yǎng)箱中避光催芽48 h，發(fā)芽后將其播種于裝有石英砂∶蛭石=2∶1（體積比）混合基質(zhì)的96孔育苗板中，待小白菜出苗后，用1/4 Hoagland營養(yǎng)液（pH 6.8）澆灌，濕度約保持在60%田間持水量。待小白菜幼苗長到兩葉一心期時，選取長勢良好、大小一致的小白菜幼苗移入裝有營養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中預(yù)培養(yǎng)3 d，待生長良好、未出現(xiàn)任何不良癥狀后開始進(jìn)行CdCl2和TiO2NPs脅迫。本實驗設(shè)置4個處理組：（1）CK，空白對照組；（2）C10，僅采用 Cd染毒，處理濃度為 10 mg·L-1；（3）T20，僅采用TiO2NPs染毒，處理濃度為20 mg·L-1；（4）C10T20，采用Cd和TiO2NPs共同染毒，其中Cd處理濃度為10 mg·L-1，TiO2NPs處理濃度為20 mg·L-1。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，實驗周期為15 d，每3 d更換1次營養(yǎng)液，每隔24 h將培養(yǎng)瓶放置于磁力攪拌器上攪拌10 min（50 r·min-1），避免TiO2NPs團(tuán)聚沉淀。整個試驗在模擬自然環(huán)境的人工氣候培養(yǎng)室進(jìn)行，人工氣候室條件：28℃/22℃（晝/夜）、相對濕度75%、光照強(qiáng)度 200 μmol·m-2·s-1，光周期 14 h/10 h（晝/夜）。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生物量的測定

暴露15 d后，將小白菜取出，蒸餾水沖洗去除植物表面殘留物，將根和地上部分離，用直尺分別測量其株高和根長；然后置于烘箱105℃殺青30 min，70℃烘至恒質(zhì)量，用分析天平稱量其干質(zhì)量。

1.3.2 超微結(jié)構(gòu)

根據(jù)Cai等[33]研究方法，將樣品用2.5%戊二醛初步固定，然后在1%四氧化二鋨中固定1 h。隨后在30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脫水，每個濃度下脫水20 min，并嵌入環(huán)氧樹脂，使用超顯微切片機(jī)將樣品切片至約70 nm厚，用1%的乙酸鈾檸檬酸鹽染色，將樣品置于銅基網(wǎng)格上，用TEM觀察。透射電鏡結(jié)合能量色散X射線能譜儀（TEMEDS）測定植物細(xì)胞中選定區(qū)域的電子致密顆粒的元素組成。

1.3.3 抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化和葉綠素含量測定

取新鮮的根、葉組織在液氮中均勻化成細(xì)粉，0.1 g均質(zhì)組織樣品與1 mL磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4，其成分主要為Na2HPO4和NaH2PO4）渦旋混合5 min（200 r·min-1），使植物樣品勻漿充分?；旌蠘悠冯x心20 min（4 ℃、3 000 r·min-1），收集上清液[34]。酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒測定CAT、POD、SOD活性和MDA含量。

采用SPAD-502葉綠素儀測定小白菜葉片組織中葉綠素含量[35]。

1.3.4 Cd、Ti的積累與轉(zhuǎn)運

依據(jù)Ji等[30]的方法，將0.2 g干組織樣品與1 mL濃硝酸（HNO3）和2 mL氫氟酸（HF）混合，在210℃下消解30 min后取出，置于電熱板上繼續(xù)加熱趕酸至剩余1 mL，冷卻后用去離子水將其定容至25 mL，通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）測定小白菜地上部和根系中Ti和Cd的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和單因素方差分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，經(jīng)鄧肯多重比較檢驗對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。利用Ori?gin 9.4對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TiO2 NPs懸浮液的分散行為

由表1可知，TiO2NPs溶于營養(yǎng)液后Dh增加為336.67 nm，這主要因為營養(yǎng)液中的金屬離子使TiO2NPs發(fā)生了團(tuán)聚。Cd的加入使得TiO2NPs的穩(wěn)定性進(jìn)一步降低。

PDI值體現(xiàn)了納米粒徑的不均一程度，其范圍為0～1。表1顯示，無論是否加入Cd，TiO2NPs樣品的PDI值均在0.1～0.6之間，說明TiO2NPs樣品具有一定的不均一性。TiO2NPs在營養(yǎng)液中雖然可能形成較大的聚集體，但其結(jié)合形式較為松散，且團(tuán)聚體邊緣處依舊存在許多納米尺度的粒子，因此，這些粒子依舊可能對生物體產(chǎn)生納米尺度的效應(yīng)。

表1 TiO2 NPs在營養(yǎng)液中的水合粒徑和Zeta電位Table 1 Hydrodynamic diameter（D h）and Zeta potential of TiO2 NPs in Hoagland solution

Zeta電位是一個表征分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。當(dāng)Zeta電位的絕對值大于30 mV時為穩(wěn)定體系。由表1可知，營養(yǎng)液作為分散介質(zhì)的體系，其中單一TiO2NPs、TiO2NPs與Cd混合液的Zeta電位的絕對值均小于30，說明該體系穩(wěn)定性較差，易團(tuán)聚產(chǎn)生沉淀。

2.2 TiO2 NPs對Cd脅迫下小白菜生物量的影響

株高、根長、干質(zhì)量是衡量小白菜幼苗生長的重要指標(biāo)。由表2可知，與CK相比，C10、C10T20處理組中小白菜的根長、株高、地上部和根部干質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05），C10T20較C10組小白菜的株高、根長、地上部干質(zhì)量和根部干質(zhì)量分別降低了5.31%、15.56%、30.23%和25.00%。從小白菜的生長狀態(tài)（圖2）可以看出，TiO2NPs對小白菜幼苗的生長無明顯毒害。C10組植株矮小，葉片黃化，根長變短。C10T20組與C10組相比，葉片黃化嚴(yán)重，葉片數(shù)減少，植株長勢更差。

2.3 TiO2 NPs對小白菜幼苗中Cd、Ti富集和轉(zhuǎn)運的影響

圖2 TiO2 NPs和Cd對小白菜生長的影響Figure 2 Effects of TiO2 NPs and Cd on growth of Chinese cabbage seedlings

表2 TiO2 NPs和Cd對小白菜生物量的影響Table 2 Effect of TiO2 NPs and Cd on the biomass of Chinese cabbage seedlings

圖3A和圖3B表明，與CK相比，C10、C10T20組的Cd含量顯著增加（P＜0.05）。與C10組相比，C10T20組中小白菜根部、地上部Cd含量分別增加了64.86%和58.30%，表明TiO2NPs增加了根部對Cd的吸收。根部總Cd含量顯著大于地上部，表明Cd主要在小白菜幼苗根部積累，只有少量轉(zhuǎn)運到地上部。C10組小白菜的TF為0.27，加入TiO2NPs后TF為0.26，說明TiO2NPs的存在雖然顯著促進(jìn)了Cd在小白菜根部和地上部的富集，但并沒有改變Cd由根部向地上部的轉(zhuǎn)運。由圖3C和圖3D可知，TiO2NPs可以進(jìn)入小白菜的根部并轉(zhuǎn)運至地上部。與T20組相比，C10T20組小白菜地上部Ti含量顯著增加了72.11%，根部Ti含量顯著增加了55.46%（P＜0.05），說明TiO2NPs促進(jìn)Cd在小白菜體內(nèi)的富集，Cd也促進(jìn)了Ti在小白菜體內(nèi)的積累。TiO2NPs在小白菜體內(nèi)的轉(zhuǎn)運系數(shù)很低，T20組為0.015，C10T20組為0.017，說明僅有少量的TiO2NPs轉(zhuǎn)運到地上部。

2.4 TiO2 NPs對Cd脅迫下小白菜生理指標(biāo)的影響

2.4.1 MDA含量

由圖4可知，與CK組相比，T20組葉片和根系MDA含量分別顯著增加了19.43%和19.03%（P＜0.05），表明TiO2NPs可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。C10組較CK組小白菜幼苗葉片MDA含量顯著增加了69.59%（P＜0.05）。C10T20組較C10組葉片中MDA含量顯著增加了14.89%（P＜0.05）。小白菜根系中MDA含量的變化趨勢與葉片相同，即加入TiO2NPs后MDA含量較C10處理顯著增加了32.09%（P＜0.05），說明TiO2NPs明顯增加了Cd對小白菜幼苗的脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞膜的損傷。

2.4.2 抗氧化酶活性

Cd脅迫導(dǎo)致小白菜幼苗葉片抗氧化防御能力發(fā)生顯著變化。圖5A表明，與CK組相比，C10組小白菜葉片的SOD活性顯著降低了6.69%（P＜0.05）；T20組小白菜葉片的SOD活性顯著增加了12.23%，SOD活性的增加能夠清除TiO2NPs脅迫產(chǎn)生的ROS，對小白菜幼苗具有保護(hù)作用。C10T20與C10相比，葉片SOD活性降低了9.70%。C10脅迫下小白菜幼苗CAT變化趨勢與SOD一致（圖5B），C10T20處理下CAT活性較C10處理顯著降低了34.82%（P＜0.05）。C10組對POD活性的影響不同于SOD和CAT（圖5C），其活性與CK相比沒有顯著性差異，表明C10處理下POD為清除植物體內(nèi)ROS的主要酶。但加入TiO2NPs后，小白菜葉片POD活性顯著降低了12.91%（P＜0.05）。說明TiO2NPs能激活小白菜的抗氧化防御體系，抵抗ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激；但與Cd共存時并未緩解Cd對小白菜的氧化脅迫，抗氧化防御能力減弱，對小白菜產(chǎn)生氧化損傷。

圖3 TiO2 NPs和Cd對小白菜幼苗Cd、Ti含量的影響Figure 3 Effects of TiO2 NPs and Cd on Cd and Ticontent of Chinese cabbage seedlings

2.4.3 葉綠素含量

由圖5D可知，C10、C10T20組的葉綠素含量比CK組均顯著下降（P＜0.05），說明Cd脅迫下，小白菜幼苗光合作用受到抑制，植株正常生長受阻，這與生長過程中小白菜葉片黃化的癥狀一致。C10T20組與C10組相比，葉綠素含量顯著降低了14.88%（P＜0.05）。由此說明TiO2NPs加強(qiáng)了Cd對小白菜幼苗光合色素合成的抑制作用，進(jìn)一步降低了光合作用速率，最終導(dǎo)致小白菜生長受阻更加嚴(yán)重。

圖4 TiO2 NPs和Cd對小白菜幼苗MDA含量的影響Figure 4 Effects of TiO2 NPs and Cd on MDA content of Chinese cabbage seedlings

2.5 小白菜根、葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

圖5 TiO2 NPs和Cd對小白菜葉片中SOD、CAT、POD活性和葉綠素含量的影響Figure 5 Effects of TiO2 NPs and Cd on SOD，CAT，and PODactivity and chlorophyll content in the leaves of Chinese cabbage seedlings

圖6 TiO2 NPs和Cd對小白菜根系、葉片超微結(jié)構(gòu)的影響Figure 6 TEMimages of Chinese cabbage and EDSspectra

采用TEM觀察了小白菜根細(xì)胞和葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（圖6）。CK組細(xì)胞質(zhì)壁結(jié)合較緊密，光滑的細(xì)胞膜緊貼于連續(xù)的細(xì)胞壁上，葉綠體呈橢圓形或梭形，基質(zhì)中的類囊體和基粒片層整齊有序地沿葉綠體長軸方向平行排列，葉綠體內(nèi)還分布著大小不一的白色淀粉粒和少量隨機(jī)分布的嗜鋨顆粒。此外，有完整的核結(jié)構(gòu)，核質(zhì)均勻，核仁清晰可見（圖6A和圖6G）。T20組發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，葉綠體上的淀粉顆粒增大（圖6B和圖6H）。圖6D和圖6J顯示，C10組出現(xiàn)質(zhì)壁分離，葉綠體與細(xì)胞壁分離，嗜鋨顆粒數(shù)量明顯增加，基粒片層和基粒類囊體失去原有的秩序而發(fā)生紊亂，液泡內(nèi)陷和脫離，胞質(zhì)組織差，顯示多泡體。C10T20組植物細(xì)胞遭受更嚴(yán)重的破壞，包括細(xì)胞壁的破壞和光合裝置的解體（圖6E和圖6K），顯示細(xì)胞壁折疊、內(nèi)陷，相較于C10組，細(xì)胞壁損傷更嚴(yán)重，質(zhì)壁分離也較明顯；葉綠體出現(xiàn)明顯損傷，橢圓葉綠體變圓，雙層膜模糊，類囊體結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)構(gòu)不完整，內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)紊亂，殘存的基粒和基質(zhì)類囊體更加腫脹、疏松。因此，當(dāng)TiO2NPs和Cd共存時，小白菜細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷比單獨Cd處理更加嚴(yán)重。

此外，與CK組和C10組相比，T20和C10T20組根系中存在明顯的TiO2NPs團(tuán)聚體，粒徑范圍為0.2～2.0μm（圖6B和圖6E）。根系的細(xì)胞質(zhì)中顯示（圖6C和圖6F），與T20組相比，C10T20組出現(xiàn)大量TiO2NPs沉積，這與前文中Cd促進(jìn)TiO2NPs在小白菜體內(nèi)的富集相一致。根系和葉片的TiO2NPs團(tuán)聚體中檢測到了Cd元素（圖6F和圖6L）。因此，TiO2NPs能進(jìn)入植物根細(xì)胞，并作為Cd的載體，將Cd攜帶進(jìn)入植物根系，并轉(zhuǎn)運到葉片。

3 討論

Cd對植物生長最直觀的毒害是植株矮小、發(fā)育遲緩、萎蔫枯黃[36]。本研究中Cd脅迫下小白菜表現(xiàn)出明顯的毒害癥狀，葉片黃化，根長、株高、干質(zhì)量均顯著低于CK組（P＜0.05）。TiO2NPs脅迫降低了小白菜的干質(zhì)量，但生長過程中無明顯毒害癥狀。TiO2NPs的存在顯著增加Cd對小白菜葉綠素含量、膜脂過氧化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抗氧化酶活性等生理參數(shù)的毒性。

TEM-EDS證實了小白菜幼苗對TiO2NPs的吸收和轉(zhuǎn)運。TiO2NPs或其聚集物穿過根細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)（圖6B和圖6E），表明植物根系中存在一種共質(zhì)體途徑。小白菜根細(xì)胞和葉細(xì)胞中分別檢測到52.73%和44.3%的Ti（圖6C和圖6I），證實內(nèi)化的TiO2NPs被小白菜根系直接吸收，然后運輸?shù)饺~片。前期研究表明粒徑小于植物細(xì)胞壁孔徑（一般為5～20 nm）的TiO2NPs能進(jìn)入細(xì)胞，例如水稻、小麥、油菜[37-39]。DLS結(jié)果顯示TiO2NPs團(tuán)聚體的Dh顯著大于根細(xì)胞壁的孔徑，因此TiO2NPs直接穿過細(xì)胞壁進(jìn)入小白菜體內(nèi)的可能性較小。粒徑顯著大于植物細(xì)胞壁孔徑的納米顆粒的內(nèi)化機(jī)制尚不清楚。一種可能的原因是納米顆粒能引起細(xì)胞壁上新孔形成和孔徑增加，使更大粒徑的納米顆粒也通過細(xì)胞壁[40]。植物細(xì)胞壁是由纖維素和果膠交結(jié)形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。植物根系受到脅迫時產(chǎn)生的ROS會造成果膠減少，并且ROS中的羥基自由基會導(dǎo)致細(xì)胞壁中木葡聚糖鏈的斷裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁疏松，氣孔增大[41]。另一項研究發(fā)現(xiàn)植物根系分泌復(fù)合物中的醋酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等物質(zhì)能改變納米顆粒在水中的性質(zhì)和存在狀態(tài)[42]。Lin等[43]研究氧化鋅納米顆粒（ZnONPs）對黑麥草產(chǎn)生毒性的作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，植物根系滲出液與周圍的納米顆粒團(tuán)聚體作用而導(dǎo)致團(tuán)聚體的粒徑變小。另一種可能是由于植物根的損傷。暴露于二氧化鈰納米顆粒（CeO2NPs）的小麥根系中，高Ce區(qū)域周圍有明顯的鉀電解質(zhì)泄漏，這是細(xì)胞破裂或損傷的一般指標(biāo)，表明CeO2NPs是通過根系損傷而不是典型的吸收途徑被吸收的[44]。通過根系斷裂和典型的吸收途徑進(jìn)入植物根系的納米顆粒的相對重要性尚不清楚，并且可能因生長條件、植物種類和納米顆粒的不同而有很大差異。本研究中，TiO2NPs和Cd脅迫導(dǎo)致根系MDA的含量顯著增加，表明小白菜根系ROS大量產(chǎn)生，誘發(fā)膜脂過氧化，因此，ROS引起的細(xì)胞壁疏松可能是本研究中TiO2NPs進(jìn)入植物根系的途徑之一。植物對納米顆粒的吸收，納米顆粒在植物體內(nèi)的分布、遷移、轉(zhuǎn)化十分復(fù)雜，許多機(jī)制上的問題還需要進(jìn)一步的深入研究。

TiO2NPs增強(qiáng)Cd對小白菜生長的抑制，株高、根長、生物量顯著降低（P＜0.05），這與小白菜根部和地上部的Cd含量相一致，兩者共暴露處理下根部和地上部的Cd含量與單獨Cd處理相比顯著增加（P＜0.05）。吸附了Cd的TiO2NPs團(tuán)聚體大量地附著在小白菜根系周圍，可能造成根系表面局部Cd濃度過高，而且TiO2NPs吸附Cd后會發(fā)生解吸現(xiàn)象，從而增加根系對Cd的吸收[45]。相關(guān)研究表明，TiO2NPs可以作為Cd在植物細(xì)胞中生物蓄積的載體[15]，這可能是影響小白菜體內(nèi)Cd吸收和轉(zhuǎn)運的重要因素。EDS結(jié)果顯示TiO2NPs和Cd的復(fù)合體被小白菜根系吸收和內(nèi)化（圖6F和圖6L），因此TiO2NPs可以作為小白菜對Cd吸收的有效載體。但不論是否加入TiO2NPs，根系依然是植物累積Cd的主要部位，TiO2NPs并沒有促進(jìn)Cd從根系向葉片的轉(zhuǎn)運，Singh等[29]也得到類似結(jié)果。本研究中TiO2NPs誘導(dǎo)根系MDA含量顯著上升，損傷細(xì)胞膜的完整性，TiO2NPs可能通過增加植物細(xì)胞膜的通透性，從而導(dǎo)致Cd進(jìn)入植物體內(nèi)[46]。Lian等[47]發(fā)現(xiàn)100 mg·L-1TiO2NPs增加了玉米植株體內(nèi)的Cd含量，引起細(xì)胞膜損傷，這與本研究結(jié)果類似；但250 mg·L-1TiO2NPs處理下玉米體內(nèi)的Cd含量降低。同時，Ji等[30]研究表明1 000 mg·L-1TiO2NPs濃度下，水稻葉片和根系的Cd含量顯著降低。這可能是由于在高濃度TiO2NPs下，大部分Cd被帶負(fù)電荷的TiO2NPs吸附而不能被根吸收。本研究所選實驗濃度遠(yuǎn)低于其他研究者的濃度，而更接近實際的環(huán)境濃度，因此更具有現(xiàn)實意義。

與CK相比，20 mg·L-1TiO2NPs對小白菜的葉綠素含量無顯著影響，10 mg·L-1Cd顯著抑制了葉綠素的合成，這反映了TiO2NPs的低毒性，Song等[48]對番茄的研究也得到類似結(jié)果。TiO2NPs與Cd聯(lián)合暴露時葉綠素含量顯著降低，引起葉片黃化。研究表明，Cd在葉片中過量積累，會與葉綠體中蛋白質(zhì)上的巰基結(jié)合，或取代其中的鐵、鎂、鋅等，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)和功能活性[49]。完整有序的類囊體結(jié)構(gòu)，能使膜電荷保持穩(wěn)定，膜成分區(qū)域化，保證植物的光合作用正常進(jìn)行[52]。本研究中，小白菜葉綠素含量的變化與葉綠體超微結(jié)構(gòu)的破壞有一定的關(guān)系。Cd脅迫下葉綠體上的嗜鋨顆粒數(shù)量明顯增加，基粒片層和類囊體失去原有的秩序發(fā)生紊亂；TiO2NPs處理下有完整的類囊體膜。兩者共暴露時，小白菜葉肉細(xì)胞的葉綠體結(jié)構(gòu)損傷程度加劇，葉綠體膨脹成球形，基粒類囊體膨脹且排列紊亂、不規(guī)則，葉綠素含量與Cd處理相比顯著降低。因此，Cd對葉綠體超微結(jié)構(gòu)的損傷可能是TiO2NPs和Cd共處理下葉綠素含量降低的主要原因。

氧化脅迫是解釋有毒物質(zhì)對生物組織或細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的主要機(jī)制之一[51]。在可調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，植物通過刺激抗氧化酶（CAT、POD、SOD）的活性來抵抗氧化應(yīng)激，但在強(qiáng)氧化條件下會失去作用，甚至降低抗氧化酶的活性，破壞抗氧化系統(tǒng)[52]。TiO2NPs通過物理作用和內(nèi)化導(dǎo)致ROS產(chǎn)生，對植物產(chǎn)生氧化應(yīng)激[53]。MDA是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，是一種重要的逆境生理指標(biāo)[54]。Cd的積累和對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷也會導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生。兩者共同作用導(dǎo)致氧化應(yīng)激作用加強(qiáng)，MDA含量顯著高于單獨Cd處理，造成膜損傷，膜系統(tǒng)的完整性喪失；SOD、POD、CAT的活性顯著降低（P＜0.05），小白菜的抗氧化系統(tǒng)被破壞，ROS大量積累，對植物產(chǎn)生毒害，這與前人在其他作物上的研究類似[47]。然而，還需要在生物化學(xué)和分子水平上進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以深入了解植物中TiO2NPs和Cd相互作用的本質(zhì)。

4 結(jié)論

（1）TiO2NPs能被小白菜根系吸收內(nèi)化，并轉(zhuǎn)運到葉片，TiO2NPs對小白菜表現(xiàn)出低毒性，引起氧化應(yīng)激，但不影響小白菜的正常生長。

（2）TiO2NPs顯著增加Cd對小白菜幼苗的毒性效應(yīng)，這主要是由于TiO2NPs攜帶Cd進(jìn)入植物體內(nèi)，增加Cd在根和葉中的積累，導(dǎo)致膜脂過氧化，植物細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和防御系統(tǒng)平衡被打破，最終表現(xiàn)為小白菜幼苗株高、根長、生物量減小。