藺俐仲， 鄧珊珊， 張 海， 徐春志*， 景書灝， 袁 林， 劉 霞， 楊 源

(1. 貴陽市草地站，貴州貴陽550081； 2. 貴州省清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州清鎮(zhèn)551400；3. 貴陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550081； 4. 貴州省息烽縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州息烽550300；5. 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550008)

2019年3月，貴州省清鎮(zhèn)市某養(yǎng)牛場(chǎng)部分牛發(fā)病，臨床癥狀表現(xiàn)精神沉郁、咳嗽、體溫升高、呼吸困難、流漿液性鼻涕。病理剖檢發(fā)現(xiàn)病變肺臟質(zhì)地變硬，肺臟表面有白色壞死灶。為確診病因，采集病牛肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、病原核酸PCR檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病料采集牛場(chǎng)病例肺臟組織作為檢測(cè)病料。

1.2 主要試劑牛支原體檢測(cè)試劑盒(購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增所需試劑(購自天根生化科技有限公司)；藥敏紙片(購自杭州微生物試劑有限公司)。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌操作將肺臟組織接種在鮮血瓊脂培養(yǎng)基，分別進(jìn)行厭氧和需氧條件下37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 分離細(xì)菌PCR檢測(cè)挑取菌落在鮮血瓊脂培養(yǎng)基純化培養(yǎng)過夜及5 mL液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜。提取分離菌DNA，應(yīng)用PCR方法對(duì)目的基因(巴氏桿菌KMT基因)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系25 μL：2×TaqMixture 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物(KMT1：5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’；KMT2：5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’)各 2 μL，模板4 μL，滅菌雙蒸水4.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(預(yù)擴(kuò)增片段457 bp)。

1.5 牛支原體PCR檢測(cè)參照牛支原體檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。采集病死牛肺臟組織，研磨后加無菌PBS 1 mL混勻，12 000 r/min離心后取上清提取樣品DNA。擴(kuò)增體系25 μL：PCR反應(yīng)液12.5 μL，酶混合物4.5 μL，模板5 μL，滅菌雙蒸水3 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(預(yù)擴(kuò)增片段602 bp)。

1.6 分離細(xì)菌藥敏試驗(yàn)選擇多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、泰妙菌素、氟苯尼考、替米考星、泰樂菌素、新霉素按照藥敏紙片法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果厭氧培養(yǎng)鮮血瓊脂培養(yǎng)基無菌落生長(zhǎng)。需氧培養(yǎng)鮮血瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)有灰白色、露珠狀小菌落；挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡(油鏡)下觀察到革蘭氏陰性短小桿菌。

2.2 分離細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果由圖1可見，PCR擴(kuò)增出457 bp特異性目的片段，確定為巴氏桿菌。

2.3 牛支原體PCR檢測(cè)結(jié)果由圖2可見，肺臟組織樣品中檢出602 bp牛支原體特異性核酸片段，提示有牛支原體感染。

2.4 巴氏桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果抑菌效果由高到低依次為：多西環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、泰妙菌素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、新霉素、泰樂菌素。

3 結(jié)論

根據(jù)臨床癥狀、病理變化、細(xì)菌分離培養(yǎng)、病原PCR檢測(cè)結(jié)果，診斷為牛支原體與巴氏桿菌混合感染。

4 治療

推薦該場(chǎng)使用對(duì)巴氏桿菌和支原體均有較好抑制效果的多西環(huán)素和氟苯尼考作為治療首選藥物(按說明書用量和方法)，同時(shí)補(bǔ)充能量和電解質(zhì)。經(jīng)治療后病情得到了有效控制。

5 討論

5.1牛支原體(Mycoplasmabovis)是柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬的成員，感染?？梢鸱窝?、乳房炎，以及懷孕母牛流產(chǎn)、生殖器感染等多種疾病[1]。牛支原體無細(xì)胞壁，以二分裂或芽生方式進(jìn)行繁殖，是目前已知能自行繁殖的最小的原核生物。1961年在美國(guó)首次從患有乳腺炎的病牛中分離到牛支原體[2]。1983年國(guó)內(nèi)首次報(bào)道從患有乳腺炎的病牛中檢出支原體[3]。2008年辛九慶等[4]從患肺炎的犢牛肺中分離出支原體。近年來，在我國(guó)貴州、廣西、甘肅、寧夏、江西、湖北、安徽、福建、湖南、河南、內(nèi)蒙古、山東、新疆等地均分離到牛支原體[5～8]。牛支原體可引起牛肺臟組織水腫變性，肺泡、氣管及支氣管產(chǎn)生炎性浸潤(rùn)[9]。本次病例表現(xiàn)的臨床癥狀與牛支原體肺炎非常相似，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)檢測(cè)確診為牛支原體感染。

5.2巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamutocida，Pm)引起畜禽的1種烈性傳染病，可引起牛、豬、雞、兔等家養(yǎng)動(dòng)物和野生動(dòng)物的敗血癥和呼吸系統(tǒng)疾病[10]。該病在秋、冬季節(jié)容易發(fā)病，發(fā)病急，傳播速度快，傳播途徑多，是危害養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一。巴氏桿菌依據(jù)莢膜抗原的不同和脂多糖抗原的不同分別分為5種血清型(A、B、D、E、F)和16種血清型(1～16)，其血清學(xué)分型對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查及致病規(guī)律的研究具有十分重要的意義。KMT基因?yàn)槎鄽⑿园褪蠗U菌的特異性基因，具有較高的保守性[11]。因此，本試驗(yàn)對(duì)病例中分離的細(xì)菌選擇針對(duì)KMT基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定，確定為巴氏桿菌。巴氏桿菌為條件致病菌，如外界環(huán)境突變、機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、免疫力下降等因素容易引起發(fā)病。貴州氣候多變，晝夜溫差大，濕度大，外地牛進(jìn)入貴州后初期很難適應(yīng)，容易出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，免疫力降低，從而增加了巴氏桿菌病的發(fā)病率。

5.3對(duì)于防治牛支原體和巴氏桿菌感染的基本原則是“防重于治”“早診斷、早治療”。目前已有牛支原體和巴氏桿菌商品化疫苗，養(yǎng)牛場(chǎng)可以根據(jù)疫病的流行情況自行開展疫苗免疫。同時(shí)要做好養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境消毒和殺蟲滅鼠工作，選擇合理治療藥物，交替使用，避免產(chǎn)生耐藥性。