田 琴， 張明華， 周碧君，2，3， 王開功，2，3*， 程振濤，2，3， 文 明，2，3*

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025； 2. 貴州省動物疫病研究室，貴州貴陽550025； 3. 貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴州貴陽550025)

近年來養(yǎng)鴨業(yè)在貴州逐漸興起并成為畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。隨著養(yǎng)殖模式的改變、養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖戶的增加，部分養(yǎng)鴨場由于養(yǎng)殖數(shù)量密度較大、養(yǎng)殖環(huán)境差、防疫不到位等因素致使疫病不斷發(fā)生，疫病的種類也不斷增多。其中常見的細菌性病原有鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、沙門氏菌(Salmonella)和鏈球菌(Streptococcus)等[1～4]；常見的病毒性病原有鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)、鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)、禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)和鴨瘟(腸炎)病毒(Duck enteritis virus，DEV)等[5～9]。2019年10月，貴州省三穗縣某養(yǎng)鴨場陸續(xù)出現(xiàn)癥狀相似的疫病，并相繼發(fā)生死亡。經(jīng)調查，該鴨場購進花邊鴨5 800只，飼養(yǎng)至40日齡時開始發(fā)病死亡，43日齡已死亡1 000余只，死亡率達17.24%。病鴨主要臨床表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，搖頭晃腦、跛足、精神沉郁、采食量下降、生長遲緩、腹瀉、羽毛凌亂等，部分鴨頭頸歪斜、死亡后呈角弓反張狀。剖檢4只病死鴨，1號病變：腹膜呈灰白色，肝臟呈土黃色，氣管有出血點；2號病變：腹腔臌氣，左側肝臟中央有灰白色壞死灶，心臟有壞死點；3號病變：腹膜呈灰白色，肝臟有瘀血斑，心臟有壞死灶，胰腺輕度腫大；4號病變：腹膜呈現(xiàn)灰白色，肝臟表面有纖維素性滲出物。為了查明病因，特進行實驗室細菌分離培養(yǎng)和相關病毒核酸檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集4只病死鴨的心臟、肝臟、脾臟作為檢測病料，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基(1)DNA/RNA提取試劑盒(購自北京世紀元亨動物防疫有限公司)、Prime ScriptTMRT Master Mix(購自TaKaRa公司)、DL-2 000 Marker(購自寶生物工程(大連)有限公司)。(2)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(購自北京索萊寶科技有限公司)；胰蛋白胨、酵母浸出粉、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(均購自杭州微生物試劑有限公司)；鮮血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室自制)。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)無菌操作取4只病死鴨的心臟、肝臟、脾臟病料，分別接種于巧克力營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。巧克力營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置于含5%CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)24 h；鮮血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱有氧培養(yǎng)24 h。

1.2.2 相關病毒核酸檢測

1.2.2.1 引物設計參考GenBank中的DuCV(登錄號：MF627690.1)REP基因序列、GPV(登錄號：MK736656.1)NS1基因序列、AIV(登錄號：HM804477.1)NP基因序列、DEV(登錄號：EF449516.1)UL6基因序列、NDV(登錄號：AF140343.1)F基因序列，利用Primer 3.0軟件設計5對引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。見表1。

表1 引物序列及信息

1.2.2.2DNA、RNA提取及cDNA的合成分別取4只病死鴨的心臟、肝臟、脾臟病料各1 g于滅菌研缽中，加入適量滅菌PBS緩沖液，常溫條件下快速研磨勻漿，8 000 r/min離心5 min取上清，采用DNA/RNA提取試劑盒提取病毒DNA和RNA，總RNA反轉錄體系10 μL：Prime Script1step Enzyme Mix 2 μL，RNA 2 μL，RNase Freed H2O 6 μL。反轉錄條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。DNA、cDNA于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3PCR擴增以cDNA為模板進行PCR擴增檢測AIV和NDV，以DNA為模板進行PCR擴增檢測DuCV、GPV和DEV。PCR反應體系25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA/DNA 2.0 μL，補ddH2O至25 μL。PCR擴增條件見表2。取PCR產(chǎn)物8 μL，于1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳。

表2 PCR擴增信息

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結果經(jīng)過厭氧培養(yǎng)和需氧培養(yǎng)24 h，各病料培養(yǎng)基均無菌落生長，提示無細菌性病原感染。

2.2 相關病毒核酸檢測結果由圖1可見：4份病料樣品均擴增出與DuCV預期片段相符的164 bp特異性核酸片段，檢出率為100%(4/4)。由圖2可見：3份病料樣品擴增出與GPV預期片段相符的589 bp特異性核酸片段，檢出率為75%(3/4)。AIV、NDV和DEV均未擴增出特異性片段。提示只存在DuCV和GPV感染。

3 結論

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、病理變化、細菌分離培養(yǎng)、病毒核酸檢測結果，診斷該養(yǎng)鴨場鴨群存在DuCV與GPV混合感染，應為本次病例的主要發(fā)病原因。

4 討論

4.1感染DuCV的鴨常表現(xiàn)出羽化障礙、生長遲緩和體重偏低，并可誘導免疫抑制并增加其他病原的感染率[10]；感染GPV表現(xiàn)為腹瀉、腳軟、滲出性腸炎[11]。這2種病原感染僅通過臨床癥狀很難進行判斷，需進行實驗室診斷。本次病例診斷結果顯示：只感染DuCV的鴨占25%(1/4)，而DuCV和GPV二重感染率高達75%(3/4)。與楊晶等[12]、Kozdruń W等[13]、Shehata Awad A等[14]、劉杰[15]對我國部分地區(qū)的鴨群發(fā)生DuCV和GPV二重感染的結果相比，本次病例的混合感染率更高。分析原因可能是：(1)本次采集的樣品數(shù)量較少，在統(tǒng)計學意義上存在一定的局限性；(2)可能引種鴨場有DuCV和GPV存在，而DuCV和GPV既可水平傳播，又可垂直傳播[16]，故本次病例感染率較高。

4.2在我國鴨群中DuCV感染不再是以單一感染的形式出現(xiàn)，與其他病原的混合感染病例呈逐漸上升趨勢[17]。GPV主要感染雛鵝或雛鴨，1956年在我國江蘇等養(yǎng)鵝地區(qū)發(fā)生疫情后，現(xiàn)已逐漸蔓延到全國，但極少感染番鴨[18]。自1997年福建省莆田、福清等番鴨飼養(yǎng)區(qū)暴發(fā)番鴨小鵝瘟并嚴重影響番鴨養(yǎng)殖發(fā)展才引起大家的重視[19]。近年來，GPV逐漸向新型鵝細小病毒(Novel goose parvovirus，NGPV)轉變，病鴨表現(xiàn)生長遲緩、喙萎縮、舌突出以及脛骨變短變脆等臨床癥狀[20]。因此，為了防止更多疫病的感染，建議養(yǎng)鴨場應結合鴨的主要疫病和當?shù)囟喟l(fā)病制定合理的綜合防控措施，包括合理的免疫計劃，加強免疫監(jiān)測和飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒，控制繼發(fā)感染，以減少鴨病的發(fā)生。