盛楠，魯冠杰，付岳，胡格

（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的季節(jié)性流行病導(dǎo)致動(dòng)物大量死亡。呼吸系統(tǒng)受到AIV 攻擊后，細(xì)胞因子早期的迅速分泌，對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。但過度持續(xù)的刺激將導(dǎo)致病理改變，甚至危及生命。病毒感染機(jī)體后，特異性配體結(jié)合靶標(biāo)，活化相關(guān)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，密切級(jí)聯(lián)的蛋白依次激活最終導(dǎo)致免疫因子的釋放。連翹酯苷A(Forsythiaside，F(xiàn)TA)是連翹風(fēng)干果實(shí)提取物，具有多種藥理作用，已被廣泛應(yīng)用于疾病的研究。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，連翹懸浮提取物可以明顯降低炎性肝損大鼠炎性因子的過表達(dá)[1]，提示我們連翹提取物具有預(yù)防損傷的潛力?；蛩降臋z測可以準(zhǔn)確地反應(yīng)出中藥作用機(jī)體后的影響變化。因此,本試驗(yàn)通過基因水平，研究FTA 對感染H9N2-AIV 后小鼠的炎癥基因水平表達(dá)的影響，探討FTA 抗病毒的免疫作用機(jī)制與相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

H9N2 型禽流感病毒效價(jià)為10-9；6～8 周齡Balb/c 小鼠（北京興隆動(dòng)物養(yǎng)殖廠）；小鼠IL-1β 檢測試劑盒（酶聯(lián)生物）；動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（天根）；UItra SYBR Mixture（江蘇康為世紀(jì)）；cDNA 合成試劑盒（全式金）；連翹酯苷A（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的處理及分組120 只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組；對照組小鼠滴鼻接種100 μL正常雞胚尿囊液，其余各組滴鼻接種LD50含量的病毒尿囊液100 μL（約10-1.78）；低劑量組、中劑量組、高劑量組給予FTA，劑量分別20、40、80 mg/kg，連續(xù)7 d。分離飼養(yǎng)防止交叉感染。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測 在3、5、7、14 d 每組分別取3 只小鼠采血，離心取血清，按照小鼠IL-1β 試劑盒說明檢測細(xì)胞因子。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測于第7d 各組隨機(jī)選取3 只小鼠，采血后剖殺取肺組織提取總RNA，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，立刻進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物序列為：MyD88-P1：5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'；P2：5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'；NF-κ B-P1：5'-CTAGAGCTGCTGGCCTTGTT-3'；P2：5'-TCTGGATTCGCTGGCTAATGG-3'；GAPDH-P1：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'；P2：5'-GATGCAGGGATGATGTTC-3'。由上海生工合成后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)，用#、*表示P＜0.05，即差異顯著；用##、**表示P＜0.01，即差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.5 抗炎因子的變化

圖1 小鼠感染H9N2-AIV 后IL-1β 變化

如圖1 所示，與對照組相比，3—14d 中模型組IL-1β 表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，第5—7d 時(shí)中劑量組與高劑量組IL-1β 表達(dá)極顯著降低（P＜0.01）；第14d 時(shí)FTA 治療后的3 組與對照組無明顯差異，其中中劑量組與模型組具有極顯著差異（P＜0.01）。

2.1 肺組織相關(guān)基因表達(dá)水平

2.1.1 肺組織中MyD88 的mRNA 變化 如圖2 所示，與對照組相比，各組上游信號(hào)MyD88 基因表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）；FTA 治療后，3 組表達(dá)量有所降低，與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 肺組織中mRNA 表達(dá)量

2.1.2 肺組織中NF-κB 的mRNA 變化 如圖3 所示，與對照組相比，模型組下游信號(hào)NF-κB 表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）；FTA治療后，3 組表達(dá)量降低，與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01）；下游信號(hào)與上游信號(hào)表達(dá)趨勢一致，且隨著FTA 治療量的增加，相關(guān)基因表達(dá)水平有所減弱。

3 討論

圖3 肺組織中mRNA 表達(dá)量

AIV 的大流行給現(xiàn)代禽業(yè)發(fā)展帶來極大的威脅，尤其是由H9N2-AIV 引起的呼吸系統(tǒng)疾病越來越普遍。機(jī)體感染AIV 后，肺臟是最易受到侵害的靶器官，肺內(nèi)部構(gòu)成的“氣血屏障”與細(xì)胞上的免疫受體在病理情況下發(fā)揮著重要作用。當(dāng)病原體等外來物質(zhì)刺激宿主細(xì)胞的相應(yīng)受體時(shí)，適配體信號(hào)分子或轉(zhuǎn)錄因子被激活，活化后的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)促炎細(xì)胞因子，調(diào)控宿主細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移細(xì)胞因子持續(xù)地增加發(fā)揮抗炎作用，早期的細(xì)胞因子分泌和抗體的快速產(chǎn)生可能是決定病癥嚴(yán)重程度關(guān)鍵因素[3]，促炎細(xì)胞因子的適量產(chǎn)生是有益反應(yīng)，而強(qiáng)烈的細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6 等[4]）產(chǎn)生將造成細(xì)胞因子風(fēng)暴，病毒誘導(dǎo)的過度免疫反應(yīng)造成炎癥浸潤使組織破壞，最終導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率的增加。

近年來，中藥抗病毒的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)問題。與西藥不同，單味中藥便可以含有多種有效成分。FTA 作為一種有效的天然抗氧化劑，在抗病毒與抗損傷中表現(xiàn)出很好的治療效果。有研究表明，F(xiàn)TA能減輕炎性損傷，其機(jī)制可能是通過抑制TLR4 受體依賴的MyD88—NF-κB 信號(hào)途徑，減少炎癥因子釋放[5]。相關(guān)的分子學(xué)研究發(fā)現(xiàn)FTA 可以作用到病毒M1 蛋白，通過干預(yù)病毒顆粒蛋白形成最終限制病毒傳播[6]。隨著不斷深入的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TA 參與多種炎癥通路的表達(dá)，通過抑制相應(yīng)受體的激活，降低免疫因子的釋放緩解機(jī)體免疫損傷反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)與治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，H9N2-AIV 感染小鼠后，引起了MyD88 與NF-κB 基因的激活，繼而造成IL-1β 持續(xù)大量的增加，導(dǎo)致機(jī)體炎性損傷；而經(jīng)過FTA 治療后，其基因表達(dá)水平與炎癥因子分泌均呈現(xiàn)下降趨勢。本研究表明，F(xiàn)TA 通過調(diào)控MyD88—NF-κB 基因表達(dá)水平，降低細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕H9N2-AIV 所致的炎性損傷，提示我們FTA 具有一定的治療作用。

綜上所述，F(xiàn)TA 可減輕AIV 感染后的病理狀態(tài)，其主要作用機(jī)制可是通過抑制MyD88—NF-κB 的基因表達(dá)，減輕炎癥因子過度釋放。而具體的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)激活途徑還有待進(jìn)一步探索，為臨床使用中藥提供更完善的依據(jù)。