梁璐，馬濤，王斌，韓忠朝

（1.天津百恩生物科技有限公司天津 300308；2.北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)股份有限公司北京 100176）

角膜作為高度特化、復(fù)雜的器官，經(jīng)常因?yàn)檠装Y或外傷等因素導(dǎo)致過度血管化、結(jié)膜化、角膜瘢痕，而引起角膜透明度下降甚至失明。治療中應(yīng)盡可能恢復(fù)角膜的完整性和透明度，角膜損傷治療的首要策略是控制炎癥，防止感染，必要時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療例如金剛砂車針、格狀切開或者結(jié)膜瓣遮蓋術(shù)等?，F(xiàn)有的促角膜修復(fù)的藥物較少，干細(xì)胞特有的組織損傷修復(fù)功能使其對角膜損傷修復(fù)的治療具有非常獨(dú)特的優(yōu)勢。

干細(xì)胞（stem cells）是各種細(xì)胞的起源細(xì)胞，依靠強(qiáng)大的組織再生能力而成為了再生醫(yī)學(xué)的重要工具。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一類具有多向分化潛能和自我更新能力的干細(xì)胞[1]，MSC 具有易獲得、易擴(kuò)增、低免疫原性和無倫理爭議等優(yōu)勢，是臨床應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞之一。MSC 具有調(diào)節(jié)血管新生的作用，表達(dá)促血管新生因子，同時(shí)也可以表達(dá)抑血管新生因子，當(dāng)與人的角膜上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，MSC 上調(diào)了VEGF 的表達(dá)，同時(shí)，也表達(dá)了抑血管新生因子TSP1，下調(diào)了MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)[2]。MSC 還具有抗瘢痕的作用，通過下調(diào)TGF-β 1 和α -平滑肌肌動(dòng)蛋白（α -SMA）并上調(diào)TGF-β 3 來發(fā)揮抗瘢痕的作用[3]。

間充質(zhì)干細(xì)胞因子群是干細(xì)胞分泌的蛋白產(chǎn)物，干細(xì)胞因子具有促修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫、抑制瘢痕產(chǎn)生等許多干細(xì)胞的生物學(xué)特性。經(jīng)對比試驗(yàn)證明，干細(xì)胞因子的治療效果和干細(xì)胞的治療效果相當(dāng)[4]。同時(shí)其使用和保存條件與蛋白類藥物相同，使用和運(yùn)輸都更加方便和經(jīng)濟(jì)。本文旨在研究間充質(zhì)干細(xì)胞因子群對大鼠角膜化學(xué)燒傷的治療作用及進(jìn)行臨床應(yīng)用的初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級健康成年SD 大鼠（購自維通利華），雌雄各半，體重200～220g，24 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，正常飲食飲水。試驗(yàn)前，裂隙燈下檢查雙眼附屬器及眼前段，排除眼部病變。

1.2 主要儀器和試劑

裂隙燈顯微鏡、裂隙燈數(shù)字圖像處理系統(tǒng)、眼科手術(shù)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、顯微鏡照相機(jī)、石蠟切片機(jī)、多媒體醫(yī)用彩色圖像病理分析系統(tǒng)等。

戊巴比妥鈉、1mol/L NaOH 溶液、抗生素滴眼液、生理鹽水、2%熒光素鈉等。

1.3 試驗(yàn)分組

對照組：生理鹽水；治療組：干細(xì)胞因子滴眼液（天津百恩生物科技有限公司制）。

1.4 角膜堿燒傷模型制備

采用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。直徑3mm 單層濾紙片浸泡在1mol/L NaOH 溶液中，使之達(dá)到飽和狀態(tài)，濾紙吸去過多堿液，將其貼敷于角膜中央40s。立即用生理鹽水沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜囊直至pH=7?；鼗\后正常飼養(yǎng)。

1.5 動(dòng)物分組及給藥治療

隨機(jī)分組，每組造模后24h 開始給藥治療，給藥15 μL/次/眼，3 次/d，使用周期20d，觀察周期21d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 角膜形態(tài)學(xué)變化觀察角膜缺損面積，在造模及治療后第1、3、7、10、14、21d，采用2%熒光素鈉染色，于裂隙燈下觀察缺損面積；觀察角膜缺損發(fā)生率及角膜穿孔率、前房積血情況。

1.6.2 角膜透明度、水腫程度檢查 造模后第1、3、5、7、10、14、21d，于裂隙燈下觀察角膜透明度、水腫程度。

角膜透明度評分標(biāo)準(zhǔn)[5]：0 分，角膜透明、無混濁；1 分，極輕度角膜淺表混濁，虹膜清晰可見；2 分，輕度角膜基質(zhì)混濁，可見瞳孔緣及虹膜血管；3 分，中度角膜基質(zhì)混濁，僅見瞳孔緣；4 分，重度角膜基質(zhì)混濁，僅見前房；5 分，極重度角膜混濁，前房亦不可見。

角膜水腫程度評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，無水腫（角膜厚度正常）；1 分，輕度水腫（角膜厚度輕度增加）；2 分，中度水腫（角膜厚度中度增加）；3 分，重度水腫（角膜厚度重度增加）。

1.6.3 角膜新生血管（CNV）長度及面積的測量觀察造模后及治療后第1、3、7、14、21d 的CNV 長度及面積。大鼠稱重，經(jīng)腹腔麻醉（同前法），采用裂隙燈數(shù)字圖像處理系統(tǒng)觀察角膜新生血管形成情況，并拍照。照片經(jīng)圖像分析，通過計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)測量從角鞏緣向心性生長的連續(xù)且彎曲度小，并于角鞏緣切線垂直的新生血管長度。以大鼠角膜9 點(diǎn)到3 點(diǎn)劃一橫線將角膜分成上下兩部分，再由12 點(diǎn)到6 點(diǎn)劃一條線，這兩條線將角膜分成4 個(gè)象限。每張圖片在4 個(gè)象限測5 個(gè)值取其平均值，得出傷后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠角膜新生血管的長度。帶入電腦數(shù)學(xué)模型公式計(jì)算面積：A=C/12×3.1416[r2-(r-1)2][5]，其中C 為CNV 累計(jì)角膜的圓周鐘點(diǎn)數(shù)，l 為CNV 從角膜緣伸入角膜的長度，r 為角膜半徑。CNV 總面積等于4 個(gè)象限面積之和。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，測量指標(biāo)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著性采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)分析檢驗(yàn)，部分資料采用多樣本等級檢驗(yàn)。

1.8 臨床療效觀察

1）臨床患寵數(shù)量：3 只寵物患貓。

2）臨床癥狀：因各種原因引起的角膜損傷或潰瘍，或行瞬膜遮蓋術(shù)，無眼部腫瘤，無蛋白過敏史。

3）臨床檢查：患寵淚液常規(guī)檢查基本正常；角膜熒光素鈉染色呈陽性，或可見角膜穿孔或潰瘍；或肉眼可見角膜水腫、渾濁，表面大量淺表新生血管形成血管翳、或肉芽組織增生等。

4）治療方法：使用前用生理鹽水沖洗患眼眼表，滴注干細(xì)胞因子滴眼液，4 次/d，連續(xù)使用；必要時(shí)與抗生素滴眼液配合使用。患寵佩戴伊麗莎白圈，防止自主撓傷或舔舐患處。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 角膜形態(tài)學(xué)修復(fù)觀察

動(dòng)物造模后，熒光觀察角膜缺損率100%。試驗(yàn)各組治療后，均出現(xiàn)不同程度的修復(fù)愈合，其中治療組的愈合快于對照組，熒光染色顯示在治療的第7d 可以顯著的觀察到治療組的角膜上皮迅速修復(fù)完成，而對照組仍有大面積的缺損，治療組的愈合時(shí)間明顯縮短，具有顯著性差異（P＜0.05，圖1）。

從角膜透明度和水腫的臨床評分來看，治療組角膜修復(fù)顯著。如圖2 所示，治療組角膜透明度評分與對照組比較，治療的第14、21d 有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 角膜新生血管觀察

圖1 各組不同時(shí)期角膜修復(fù)熒光染色比較

圖2 各組不同時(shí)期角膜水腫度和透明度比較

圖3 各組不同時(shí)期角膜新生血管觀察

造模及治療后各組均有不同程度的血管新生情況，其中治療組的新生血管短且粗。隨著治療時(shí)間的延長，對照組的新生血管變的又細(xì)又長，深入角膜中央，而治療組的大部分角膜新生血管逐漸消失，角膜逐漸透明。治療組的新鮮血管明顯要少于對照組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。干細(xì)胞因子在加速修復(fù)的同時(shí)，抑制新生血管的過度生長，從而提高角膜愈合后的透明度。

圖4 病例一患寵使用干細(xì)胞因子滴眼液治療前后對比圖

2.3 干細(xì)胞因子在寵物眼科臨床治療觀察

病例一為1 歲公貓，因角膜外觀異常來院就診。臨床檢查可見威脅反應(yīng)正常，淚液量正常，熒光素染色陽性，可見角膜穿孔，纖維素樣物滲出，未見眼內(nèi)翻及異位睫毛等異常。因畜主拒絕手術(shù)治療，遂單純使用藥物治療。給予干細(xì)胞因子滴眼液治療，同時(shí)配合抗生素滴眼液，4 次/d，逐日使用。結(jié)果顯示，干細(xì)胞因子滴眼液治療3 周后患寵角膜穿孔愈合（圖4）。

病例二患貓，不明原因角膜潰瘍在外院接受治療，未見好轉(zhuǎn)，后轉(zhuǎn)院。檢查可見熒光素染色陽性，角膜潰瘍，行瞬膜遮蓋術(shù)，術(shù)后1 月拆線。拆線后見角膜水腫及表面肉芽組織增生，并出現(xiàn)眼瞼內(nèi)翻。行眼瞼內(nèi)翻矯正術(shù)后使用干細(xì)胞因子滴眼液修復(fù)角膜，4 次/d，連用3d。結(jié)果顯示，干細(xì)胞因子滴眼液治療3d 后，角膜水腫明顯改善，角膜透明度恢復(fù)，表面肉芽組織消失（圖5）。

圖5 病例二患寵使用干細(xì)胞因子滴眼液治療前后對比圖

病例三布偶貓，因左眼結(jié)膜炎就診，經(jīng)口服藥物和常規(guī)滴眼液配合治療一月，期間角膜緣出現(xiàn)明顯血管化，密度逐漸升高并向視軸區(qū)蔓延，持續(xù)惡化。檢查可見淚量檢查正常，熒光素染色和細(xì)胞學(xué)檢查因客觀原因未進(jìn)行，可見明顯角膜表面大量淺表新生血管形成血管翳，無眼瞼內(nèi)翻、雙行睫等。診斷為結(jié)膜炎誘發(fā)慢性角膜炎，并發(fā)血管翳，角膜潰瘍及嗜酸性角膜炎待排查。隨后給予患眼干細(xì)胞因子滴眼液，4 次/d，逐日使用。結(jié)果顯示，使用干細(xì)胞因子滴眼液治療4d 后，患眼角膜透明度增加，血管翳基本消失（圖6）。

3 討論

圖6 病例三患寵使用干細(xì)胞因子滴眼液治療前后對比圖

角膜損傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的、多種細(xì)胞因子協(xié)同、多種細(xì)胞參與的過程。角膜不同程度的損傷其愈合過程需要不同細(xì)胞及細(xì)胞因子的參與[6]，上皮細(xì)胞可在表皮生長因子（EGF）等細(xì)胞因子的激活作用下快速進(jìn)行增殖，并由邊緣向損傷區(qū)域遷移，從而完成對損傷區(qū)域的填補(bǔ)和修復(fù)，恢復(fù)角膜上皮的完整性。當(dāng)上皮損傷范圍較大且嚴(yán)重時(shí)，角膜緣干細(xì)胞的參與變得不可或缺（圖7），是角膜組織再生能力的重要保障。損傷發(fā)生后其在胰島素樣生長因子（IGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β ）等細(xì)胞因子的作用下被激活，開始增殖并產(chǎn)生瞬時(shí)擴(kuò)增上皮細(xì)胞，瞬時(shí)擴(kuò)增上皮細(xì)胞最終分化為成熟的上皮細(xì)胞并不斷從角膜緣基底層向角膜表層和角膜中央遷移，這個(gè)過程將使得角膜的傷口逐漸縮小直至閉合。

圖7 干細(xì)胞因子治療角膜損傷機(jī)制示意圖

基質(zhì)層中的角細(xì)胞在肝細(xì)胞生長因子（HGF）、TGF-β、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等因子的刺激下啟動(dòng)向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。激活后的成纖維細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行重構(gòu)，進(jìn)而完成對基質(zhì)層傷口的填充和閉合。

角膜內(nèi)皮細(xì)胞不具有再生能力，當(dāng)角膜內(nèi)皮損傷時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞可在TGF-β 等細(xì)胞因子的作用下完成“上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化”，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生延展遷移從而完成對傷口的閉合。

研究發(fā)現(xiàn)，MSC 可以分化成多種類型細(xì)胞，例如，脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞[7]，同時(shí)它也能轉(zhuǎn)分化成為其他胚層的細(xì)胞，例如神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞等[8]；有研究報(bào)道MSC 可以分化成角膜上皮細(xì)胞，表達(dá)角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記的CK3，進(jìn)而參與角膜上皮的損傷修復(fù)[9]；MSC 也可以遷移至角膜基質(zhì)中，分化成除上皮細(xì)胞以外的其它類的細(xì)胞[10]。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，MSC 的治療作用更多是通過旁分泌作用來實(shí)現(xiàn)的，而不是直接分化。MSC 通過分泌一系列促進(jìn)組織損傷修復(fù)的因子[11-14]，例如血小板來源生長因子（PDGF）、bFGF、TGF、HGF、EGF 等來促進(jìn)角膜上皮的增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)角膜上皮的再上皮化。MSC 還具有抗炎作用，它通過分泌抗炎因子（例如IL-10、TSG-6）和抑制促炎因子（例如IL-1a、IL-6、IL-17、IFN-g、G-CSF、GM-CSF、MIP-2a、MCP-1）來發(fā)揮抗炎作用[15]。動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，移植含有MSC 的羊膜到化學(xué)燒傷模型動(dòng)物的角膜上，移植4周后，角膜中炎性因子IL-2、MMP2 的表達(dá)是被抑制的，而抑制炎癥防止了角膜的進(jìn)一步損傷[16]。其他研究團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)將MSC 移植到角膜可以抑制炎性因子IL-2 和干擾素（IFN-γ ）的表達(dá)，提高了抑炎因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β 1）的表達(dá)[2]。

4 結(jié)束語

綜上所述，角膜各層的修復(fù)均有賴于各種細(xì)胞的參與，而細(xì)胞的參與則必須經(jīng)過多種細(xì)胞因子的激活和調(diào)節(jié)。細(xì)胞因子在細(xì)胞增殖再生及組織修復(fù)中的重要作用恰恰是近年來生物醫(yī)學(xué)的重要成果，諸如EGF、bFGF 等作為有效成分的單因子藥物已應(yīng)用于眼科臨床多年。間充質(zhì)干細(xì)胞因子群是MSC 分泌的蛋白產(chǎn)物，富集多種細(xì)胞因子，集合了干細(xì)胞的促修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫、抑制瘢痕產(chǎn)生等許多生物學(xué)特性（表1）。試驗(yàn)藥效學(xué)及臨床應(yīng)用顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞因子群可以參與角膜各層的細(xì)胞修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)角膜愈合，同時(shí)抑制瘢痕的生成。

表1 干細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng)