王雪菲，樊曉亮，王新茹，霍亞蕾，蘇筱雨，朱會(huì)營(yíng)，閻愛華，李會(huì)平

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2 河北霧靈山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心，河北 承德 067300；3 天域生態(tài)環(huán)境股份有限公司，上海 200082)

核桃(JuglansregiaL. )為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)，屬多年生落葉喬木，世界四大堅(jiān)果之一，有“木本油料王”之稱[1-2]。因核桃具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用、經(jīng)濟(jì)價(jià)值，使得人們對(duì)核桃的需求量越來越大，全球核桃種植面積逐年擴(kuò)大[3-5]。核桃炭疽病是危害核桃的主要病害之一，主要為害果實(shí)、葉片等，具有潛伏期長(zhǎng)、爆發(fā)性強(qiáng)、發(fā)病時(shí)間短等特點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)落果率達(dá)85%以上，嚴(yán)重影響核桃的質(zhì)量和產(chǎn)量[6-8]。河北省是核桃生產(chǎn)大省，面積9.7萬hm2，產(chǎn)量97萬t[2]。近年來，核桃炭疽病在河北省發(fā)生面積逐年增加，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。但目前生產(chǎn)上還沒有有效的防治方法。

越冬是病害侵染循環(huán)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，掌握病原菌的越冬方式及場(chǎng)所，對(duì)搞好預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及防治有著重要的意義。前人研究表明核桃炭疽病病原菌以分生孢子和菌絲體的形式在病組織上、土壤中越冬，成為第2年病害的初侵染源[7-9]。因此，以核桃不同部位為試材，計(jì)算子實(shí)體率，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，分離病原菌，確定核桃炭疽病病原菌在河北的越冬場(chǎng)所及方式，為制定核桃炭疽病綜合防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣

2018年12月和2019年3月，在河北省邢臺(tái)市臨城縣核桃園內(nèi)采樣，采集核桃樹樹上發(fā)病的帶果柄果實(shí)和帶芽枝條，樹下落果、落葉以及表層土。將采集的材料裝入無菌紙袋并做好標(biāo)記帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 越冬病原菌子實(shí)體觀察 將上述采集的不同部位材料，借助放大鏡觀察是否有核桃炭疽病病原子實(shí)體，做好記錄。子實(shí)體率計(jì)算公式如下：

R=P/S×100

(1)

式中，R為子實(shí)體率(%)，P為帶有實(shí)體的果實(shí)(果柄、果枝、落果、葉片、芽)數(shù)，S為總果實(shí)(果柄、果枝、落果、葉片、芽)數(shù)。

1.2.2 越冬病原子實(shí)體萌發(fā)測(cè)定 從樹上果柄、果殼、落果組織上取下子實(shí)體，放入裝有無菌水的10 mL離心管內(nèi)，QL-901漩渦器充分震蕩，制成孢子懸浮液，每個(gè)視野50～80個(gè)孢子。將PD培養(yǎng)液和制備好的孢子懸浮液用移液槍各吸取50 μL先后滴加到載玻片上，輕輕混勻。將載玻片放入大培養(yǎng)皿中，用含無菌水棉球保濕。置于30 ℃、RH=95%培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。利用顯微鏡每隔2 h觀察1次孢子萌發(fā)情況，一直觀察24 h。每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀察5個(gè)視野。孢子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：芽管長(zhǎng)度超過孢子直徑長(zhǎng)度(直徑最小的一邊)的一半，確定為已經(jīng)萌發(fā)的孢子。計(jì)算公式如下：

G=C/T×100

(2)

式中，G為孢子萌發(fā)率(%)，C為孢子萌發(fā)數(shù)，T為孢子總數(shù)。

1.2.3 越冬病原營(yíng)養(yǎng)體的分離培養(yǎng) 植物材料中病原菌的分離：每個(gè)部位剪成1 cm×1 cm的組織段，共40段。在超凈工作臺(tái)中參照《植病研究方法》進(jìn)行分離[10]。具體操作如下：將組織段在75%酒精中浸泡30 s，用0.1%HgCl2消毒3 min，無菌水沖洗3次(為檢查消毒是否徹底，取100 μL的第3次洗滌液，均勻涂抹在PDA培養(yǎng)基表面，觀察是否有微生物長(zhǎng)出)。每皿放入4小段，共10皿，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。逐日觀察長(zhǎng)出菌絲的組織段數(shù)量及形成菌落的色澤和形狀等，對(duì)比核桃炭疽病病菌菌落特征，對(duì)其他菌類進(jìn)行排除，做好詳細(xì)記錄。分離率計(jì)算公式如下：

I=M/A×100

(3)

式中，I為分離率(%)，M為分離得到的病原菌數(shù)，A為總分離數(shù)。

土壤中病原菌的分離：稱取土壤1 g，無菌水9 mL，置于10 mL離心管中，充分震蕩，稀釋成10-2、10-3濃度的土壤懸浮液。吸取100 μL土壤懸浮液加入含有抗生素的PDA培養(yǎng)基中，用涂布器涂抹均勻。倒置在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次。逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，做好詳細(xì)記錄， 1 g土壤的含菌量計(jì)算公式如下：

F=F1×10×D

(4)

式中，F(xiàn)為1 g土壤含菌量，F(xiàn)1為100 μL土壤懸浮液含菌量，D為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果及分析

2.1 子實(shí)體在核桃樹不同部位的越冬情況

核桃炭疽病菌的子實(shí)體在不同部位的著生情況見表1。

表1 不同部位核桃炭疽病菌的子實(shí)體著生率

Table 1 Fruiting body occurrence rate of different parts of walnut anthracnose %

時(shí)間Time落葉Fallen leaves落果Fruit drop樹上果殼Husk onthe boughs樹上果柄Fruit stalkon the boughs芽鱗Bud scale枝條Branches2018年12月099.66100.0071.79002019年3月0100.00100.0090.3400

由表1可得，在越冬季節(jié)，核桃炭疽病病原菌的子實(shí)體主要在落果、樹上果殼、果柄中著生，在葉片、枝條以及芽鱗中沒有發(fā)現(xiàn)病原菌的子實(shí)體。在落果、樹上果實(shí)中的子實(shí)體率接近100%，在果柄上的子實(shí)體率為71.79%、90.34%。

2.2 不同部位子實(shí)體的萌發(fā)結(jié)果

不同部位核桃炭疽病菌子實(shí)體的萌發(fā)結(jié)果見表2。

表2 不同部位核桃炭疽病菌的子實(shí)體萌發(fā)率

Table 2 Germination rate of fruiting body of different partsof walnut anthracnose%

時(shí)間Time落果Fruit drop樹上果殼Husk onthe boughs樹上果柄Fruit stalk onthe boughs2018年12月94.8595.332.412019年3月94.3696.822.86

由表2可知，2018年12月和2019年3月的落果、樹上果殼的萌發(fā)率在24 h時(shí)均為95%左右，果柄萌發(fā)率僅有2.5%左右。表明越冬期間子實(shí)體內(nèi)的孢子在落果、樹上果殼中保持較高的萌發(fā)率，可以作為第2年初侵染源。

2.3 病原菌營(yíng)養(yǎng)體在不同部位的越冬情況

2.3.1 植物組織中病原菌的分離 不同植物組織中核桃炭疽病菌的分離情況見表3。從表3中可以看出，利用PDA培養(yǎng)基對(duì)不同組織進(jìn)行病原菌營(yíng)養(yǎng)體的分離，2次采集的組織均可分離出核桃炭疽病菌。2018年12月試驗(yàn)結(jié)果表明：果殼、果仁、果柄、芽鱗、枝條、落果果殼與落果果仁的分離率均在90%以上，而葉片和葉柄的分離率較低，分別為5.83%和40.83%。

表3 不同部位病原菌菌絲體的平均分離率

Table 3 Average isolation rate of pathogenic mycelium from different sites %

時(shí)間Time葉片Leaf葉柄Petiole樹上果殼Husk onthe boughs樹上果仁The tree nuts樹上果柄Fruit stalkon the boughs樹上芽鱗Bud scale樹上枝條Branches落果果殼Husk offruit drop落果果仁Kernelof fruit drop2018年12月5.8340.8399.3898.7595.8797.50100.0096.4493.502019年3月2.5027.5961.2568.7562.5078.7567.2268.7581.25

2019年3月試驗(yàn)結(jié)果表明：果殼、果仁、果柄、芽鱗、枝條、落果果殼與落果果仁的分離率均在60%以上，葉柄和葉片的平均分離率較低，分別為2.5%和27.59%。2次試驗(yàn)結(jié)果表明，核桃炭疽病病原菌以菌絲體形式在果殼、果仁、果柄、芽鱗、枝條、落果、落葉中越冬。2019年3月的病原菌菌絲體的分離率低于2018年12月，說明低溫可以殺死部分病原菌。

2.3.2 土壤中病原菌的分離 土壤中核桃炭疽病菌的分離情況見表4。

表4 不同時(shí)間下土壤中病原菌數(shù)量Table 4 Number of pathogens in soil at different time 個(gè)/g

由表4可知，2018年12月、2019年3月2次試驗(yàn)中，核桃炭疽病病原菌可以在土壤中以菌絲體的形式越冬存活，成為新一年的初侵染來源。

3 結(jié)論與討論

研究表明，核桃炭疽病病原菌能夠以子實(shí)體形式越冬，主要在核桃發(fā)病的果殼和落果上越冬，越冬后子實(shí)體萌發(fā)率分別為94.36%，96.82%。該病原菌能夠以菌絲體的形式越冬，主要在果實(shí)、果柄、落果、枝條、芽鱗中越冬，越冬后病原菌分離率達(dá)60%～82%，其次是葉柄，病原菌分離率為27.59%。該病原菌能夠在土壤中越冬，越冬后1 g土壤中病原菌數(shù)量為2.0×105個(gè)。了解核桃炭疽病病原菌的越冬方式及場(chǎng)所，對(duì)該病害的防治具有重要的指導(dǎo)意義。根據(jù)上述研究結(jié)果，核桃采收后，結(jié)合修剪等工作，清除病弱枝、病果及病葉，以減少初侵染源，是核桃炭疽病防治的重要防治措施。

本研究表明核桃炭疽病病原菌越冬后分離率較高，劉霞研究表明核桃炭疽病菌越冬后分離率較低，病原菌的孢子萌發(fā)以及菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍為10～40 ℃，研究結(jié)果與上述研究不同，可能原因是地理位置和氣候特點(diǎn)不同，或病原菌種類不同，或其寄主與生長(zhǎng)環(huán)境不同等[9]。劉金宇等研究表明核桃葉斑病病原菌以菌絲體的形式在土壤中越冬，不同深度土層中病原菌的數(shù)量存在差異，隨著土層深度的增加病原菌的數(shù)量減少[11]。本研究對(duì)核桃炭疽病在林下表層土壤中越冬進(jìn)行研究，尚未對(duì)不同深度的土層分別采樣研究，因此核桃炭疽病越冬病原菌在不同土層深度的土壤中數(shù)量是否不同有待研究。