秦瑞英，魏鵬程

前沿聚焦

Prime editing引導(dǎo)植物基因組精確編輯新局面

秦瑞英，魏鵬程

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，安徽省水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031

由于植物細(xì)胞內(nèi)同源重組頻率較低、供體傳遞受限等原因，對(duì)植物基因組進(jìn)行精準(zhǔn)編輯十分困難。近期，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了適用于植物的引導(dǎo)編輯器(plant prime editor, PPE)系統(tǒng)，并在重要作物水稻和小麥中完成了引導(dǎo)編輯。該系統(tǒng)不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，仍可高度準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)所有可能的12種單堿基替換、多堿基替換及片段缺失插入，從而為植物基因組精確編輯提供了多用途工具。本文介紹了PPE的組成結(jié)構(gòu)和編輯能力，同時(shí)也結(jié)合其他研究組隨后發(fā)表的報(bào)告綜述了植物引導(dǎo)編輯器的優(yōu)化探索，為合理使用PPEs和繼續(xù)開展優(yōu)化工作提供幫助。

引導(dǎo)編輯；精確編輯；CRISPR；基因編輯；作物

CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)基因編輯系統(tǒng)正日益深刻地影響著植物學(xué)研究的發(fā)展。該系統(tǒng)利用在植物基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double strand break, DSB)，通過錯(cuò)誤傾向性的非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)機(jī)制可修復(fù)失活的目標(biāo)基因[1]。由于NHEJ修復(fù)介導(dǎo)的堿基插入缺失(InDel)存在一定的隨機(jī)性，因此難以實(shí)現(xiàn)精確的基因組編輯。盡管借助于同源介導(dǎo)修復(fù)(homology-directed repair, HDR)機(jī)制，CRISPR-Cas系統(tǒng)可在外源DNA供體(donor)的指導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的堿基替換或片段插入缺失[2]，但是在植物細(xì)胞中，由于同源重組頻率偏低和DNA供體遞送困難，CRISPR介導(dǎo)的HDR效率顯著受限，往往也難以實(shí)現(xiàn)高效的基因組精確編輯[1,3]。堿基編輯(base editing)是新近發(fā)展的不依賴于HDR而介導(dǎo)基因組精確堿基替換的新型基因編輯技術(shù)[4]。目前堿基編輯工具包括胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor, ABE)兩類。CBE工具是以剪切活性受損的Cas蛋白(如Cas9 nickase, nCas9或catalytically dead Cas12a, dCas12a等)融合胞嘧啶脫氨酶(如rAPOBEC1、PmCDA、hAID1或hAPOBEC3等)發(fā)展而來；而ABE工具則多是利用定向進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶TadA*7.10或TadA-8e融合nCas9構(gòu)成。在多種植物中，CBE和ABE均可有效介導(dǎo)G?C-to-A?T的堿基轉(zhuǎn)換，為植物基因組精確編輯提供了新的有效策略[1]。但是，堿基編輯系統(tǒng)也存在著一定問題和局限性[5]。一方面，現(xiàn)有的堿基編輯器僅能完成特定的4種形式的堿基轉(zhuǎn)換，缺乏完成精確可控的堿基顛換或者片段插入缺失等其他基因組編輯的能力；另一方面，堿基編輯往往僅能在向?qū)NA (guide RNA)識(shí)別區(qū)域中有限編輯窗口內(nèi)發(fā)揮高效作用，編輯區(qū)域受到編輯器Cas蛋白PAM (protospacer adjacent motif)識(shí)別能力和編輯器窗口范圍的雙重限制，因此無法編輯基因組中一些重要位點(diǎn)。此外，堿基編輯器自身編輯的精確性還有待進(jìn)一步優(yōu)化。例如，編輯器脫氨酶，特別是CBE的胞嘧啶脫氨酶，存在序列非特異活性，可能在全基因組范圍出現(xiàn)脫靶[6,7]；同時(shí)當(dāng)編輯窗口內(nèi)存在多個(gè)可編輯堿基時(shí)，編輯器在編輯目標(biāo)堿基時(shí)也會(huì)造成其他非靶向的堿基突變(bystander mutation)[8]。

2019年底，美國哈佛大學(xué)David Liu研究組報(bào)道了不同于堿基編輯的基因組精確編輯技術(shù)，即引導(dǎo)編輯(prime editing)系統(tǒng)[8]。該系統(tǒng)利用nSpCas9 (H840A)和工程化改造M-MLV RT逆轉(zhuǎn)錄酶(mo-loney murine leukemia virus reverse transcriptase)融合構(gòu)建引導(dǎo)編輯器(prime editor)，由pegRNA (prime editing guide RNA)中g(shù)uide RNA部分引導(dǎo)在人細(xì)胞基因組靶位置附近形成編輯鏈上的單鏈切口，進(jìn)而通過pegRNA中的PBS(primer binding site)序列引導(dǎo)以含有目標(biāo)編輯序列的逆轉(zhuǎn)錄模板(RT template)將突變精確導(dǎo)入基因組中(圖1)。相對(duì)于CRISPR介導(dǎo)、依賴于HDR的精確編輯，引導(dǎo)編輯的效率更高，副產(chǎn)物更少。而相對(duì)于堿基編輯，引導(dǎo)編輯也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢：(1)引導(dǎo)編輯可完成的編輯類型更為廣泛，不僅可以實(shí)現(xiàn)12種任意類型的堿基替換，還可精確高效地導(dǎo)入44 bp以內(nèi)的小片段插入、80 bp以內(nèi)的片段缺失以及復(fù)雜形式混合突變；(2)引導(dǎo)編輯受PAM的限制相對(duì)較小，在長達(dá)33 nt的PAM遠(yuǎn)端序列內(nèi)，多個(gè)位點(diǎn)都可以高效編輯；(3)引導(dǎo)編輯更為精準(zhǔn)，當(dāng)在目標(biāo)位點(diǎn)附近有多個(gè)相同堿基時(shí)，不會(huì)受到堿基編輯器bystander mutation問題的困擾。在此基礎(chǔ)上，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了適于植物表達(dá)的引導(dǎo)編輯工具，并成功地在水稻(L.)和小麥(L.)中完成了DNA精確編輯[3]。這項(xiàng)工作創(chuàng)制了靈活、多用途的植物精確編輯工具，為植物基因組編輯提供了新路徑。

圖1 引導(dǎo)編輯工作模型

引導(dǎo)編輯器由DNA切割活性部分缺失的nSpCas9 (H840A)和通過逆轉(zhuǎn)錄負(fù)責(zé)修復(fù)的M-MLV兩個(gè)結(jié)構(gòu)域融合而成。在非靶標(biāo)鏈產(chǎn)生單鏈缺口后，引導(dǎo)編輯器在引物結(jié)合位點(diǎn)序列幫助下結(jié)合在斷裂位點(diǎn)，利用逆轉(zhuǎn)錄活性在逆轉(zhuǎn)錄模板的指導(dǎo)下修復(fù)單鏈斷裂并導(dǎo)入目標(biāo)突變。

1 引導(dǎo)編輯可用于植物細(xì)胞內(nèi)DNA編輯

植物引導(dǎo)編輯器(plant prime editor, PPE)由nCas9 (H840A)與M-MLV RT變體(M-MLV RT D200N/L603W/T330P/T306K/W313F)的融合基因經(jīng)植物偏好密碼子優(yōu)化而來。與用于動(dòng)物細(xì)胞編輯的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)類似[8]，PPE系統(tǒng)可根據(jù)表達(dá)向?qū)?RNA的不同分為PPE2、PPE3和PPE3b三類。PPE2僅表達(dá)pegRNA用于定位靶點(diǎn)和引導(dǎo)編輯；PPE3則同時(shí)表達(dá)pegRNA和額外的、靶向非編輯鏈的sgRNA (nicking sgRNA)，在PPE導(dǎo)入突變形成不完全配對(duì)的DNA雙鏈后，nicking sgRNA可通過剪切非編輯鏈提高以編輯鏈為模板修復(fù)的概率從而增強(qiáng)編輯效率。由于nicking sgRNA引導(dǎo)的單鏈缺刻可能產(chǎn)生插入缺失突變而降低了編輯的精確度，因此利用非完全匹配sgRNA構(gòu)建的PPE3b系統(tǒng)則在增強(qiáng)引導(dǎo)編輯效率的同時(shí)避免InDel的過多產(chǎn)生。

利用水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，PPE3b可精確編輯藍(lán)色熒光蛋白(blue fluorescent protein, BFP)產(chǎn)生CC-to-GT突變而將其轉(zhuǎn)換為綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)。在該系統(tǒng)中，PPE3b的編輯效率約為4.4%。PPE2和PPE3/3b也可編輯植物基因組位點(diǎn)。在水稻原生質(zhì)體中，利用PPE精確導(dǎo)入的6 bp片段刪除效率可達(dá)8.2%；而3 bp堿基插入的效率約為2.0%。在水稻或小麥基因組的多個(gè)位點(diǎn)，PPE均能完成不同形式的堿基轉(zhuǎn)換或顛換，充分展示了引導(dǎo)編輯的廣適性和靈活性。有趣的是，與人源細(xì)胞不同，植物細(xì)胞中的PPE3/3b的效率較PPE2并沒有顯著增強(qiáng)，暗示著植物引導(dǎo)編輯可能具有一定特殊性。進(jìn)一步在水稻原生質(zhì)體中的研究利用 PPE3在4個(gè)基因組位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了所有12種可能的堿基替換，效率在0.2%~8.0%之間。此外，PPEs也可在水稻基因組不同位點(diǎn)完成多種不同的多堿基替換、小片段缺失和插入等形式的精確編輯。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，PPE3可在水稻再生株系中精確導(dǎo)入單堿基、多堿基替換、目標(biāo)序列插入或刪除。因此，PPE系統(tǒng)是有效的精準(zhǔn)編輯工具，為不受限制的開展植物基因組精確編輯提供了新路徑。值得注意的是，成都電子科技大學(xué)張勇團(tuán)隊(duì)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所夏蘭琴團(tuán)隊(duì)、北京市農(nóng)林科學(xué)院楊進(jìn)孝團(tuán)隊(duì)、中國科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康團(tuán)隊(duì)、沙特阿拉伯阿卜杜拉國王科技大學(xué)Mahfouz團(tuán)隊(duì)以及本團(tuán)隊(duì)也陸續(xù)報(bào)道了類似結(jié)構(gòu)的植物PE編輯工具[9~14]。通過瞬時(shí)表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)，這些工具在植物細(xì)胞中也均可精確的編輯外源轉(zhuǎn)入DNA或內(nèi)源基因組靶標(biāo)，為PPE系統(tǒng)的植物基因組編輯能力提供了補(bǔ)充和驗(yàn)證。

2 PPE的優(yōu)化探索

編輯系統(tǒng)的產(chǎn)物純度和效率直接影響方法的實(shí)用性，是需要著重優(yōu)化的指標(biāo)。例如，早期開發(fā)的CBE類堿基編輯工具常產(chǎn)生InDel或非C-to-T的編輯副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響了編輯能力[15]。PPE也可能產(chǎn)生編輯副產(chǎn)物，主要體現(xiàn)為pegRNA骨架序列插入或替換編輯位點(diǎn)序列，但一般頻率不高(0.5%~4.9%)，對(duì)于植物基因組精確編輯影響不大。而編輯效率是PPE系統(tǒng)迫切需要改進(jìn)的主要方面。一方面，在原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，PPE對(duì)BFP上CC-to-GT突變的誘導(dǎo)率(4.4%)小于植物堿基編輯器PBE (plant base editing) (6.6%)，在水稻基因組位點(diǎn)上PPEs的效率也低于PBE，暗示著植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)效率相對(duì)受限。由PPE3誘導(dǎo)的穩(wěn)定編輯株系均為嵌合突變而沒有純合突變，也表明PPE的效率需要繼續(xù)優(yōu)化。另一方面，與動(dòng)物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)類似，植物PPE效率與PBS長度、RT template長度、nicking sgRNA的選擇乃至導(dǎo)入突變類型等參數(shù)高度相關(guān)[3,12,13]，使用現(xiàn)有效率相對(duì)受限的PPE工具編輯基因組特定位點(diǎn)需要構(gòu)建和測試不同結(jié)構(gòu)的pegRNA和nicking RNA，因此急需高效穩(wěn)定的PPE系統(tǒng)降低時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在一些Cas9可高效編輯的位點(diǎn)PPE效率反而相對(duì)受限[6]。因此，可以懷疑在RT活性不足導(dǎo)致精確編輯效率偏低。由于植物的培養(yǎng)溫度往往低于M-MLV的最適反應(yīng)溫度，因此在編輯過程中提高溫度可能增加效率。相對(duì)于常規(guī)的26℃培養(yǎng)，升溫至37℃能夠顯著的提升PPE3b在一些靶點(diǎn)的編輯效率[3]。但是也有獨(dú)立報(bào)道表明，相對(duì)于32℃，37℃培養(yǎng)并不能明顯提升編輯效率[12]，這可能是由于處理方式、材料自身?xiàng)l件、靶位點(diǎn)序列結(jié)構(gòu)等多種原因造成。這些結(jié)果也暗示著通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高prime editing效率是可行的，但仍然需要大量探索。利用不同來源或進(jìn)化版本的脫氨酶是提高堿基編輯器編輯能力的常用策略[15]。與之類似，嘗試不同的RT顯然是優(yōu)化PPE的思路之一。然而，盡管利用花椰菜花葉病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(cauliflower mosaic virus RT, RT-CaMV)或大腸桿菌retron-derived RT (RT-retron)替代PPE中M-MLV RT構(gòu)建的PPE- CaMV和PPE-retron可將外源轉(zhuǎn)入的BFP編輯為GFP，但其效率僅接近或略低于PPE3b；同時(shí)在水稻基因組靶點(diǎn)上，PPE-CaMV也并沒有表現(xiàn)出穩(wěn)定的高出PPE的活性。

在植物CRISPR系統(tǒng)中，利用Pol II啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基于核酶(ribozyme)加工的sgRNA表達(dá)策略往往能獲得較高編輯效率[16]；在植物引導(dǎo)編輯中利用該策略構(gòu)建了PPE-ribozyme (PPE-R)系統(tǒng)。在水稻基因組的部分位點(diǎn)，PPE-R也可顯著提高編輯效率，但是在有些位點(diǎn)編輯反而受到抑制。單一Pol III啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)tRNA串聯(lián)sgRNA陣列也是植物CRISPR基因編輯常用的sgRNA表達(dá)優(yōu)化手段[17]；這種模式也被用于植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)中pegRNA和nicking sgRNA的表達(dá)[11,12]。與PPE-R相似，tRNA串聯(lián)在部分靶點(diǎn)具有一定的效率提升作用，但是并不能在所有位點(diǎn)將植物引導(dǎo)編輯提升到較高水平。另一方面，植物基因編輯效率與編輯器蛋白表達(dá)量也密切相關(guān)?；谑Щ羁剐詷?biāo)記的替代編輯系統(tǒng)(surrogate system)或編輯器–抗性標(biāo)記融合表達(dá)系統(tǒng)(如ABE-HPT)可通過抗性篩選富集可能出現(xiàn)編輯的植物細(xì)胞，從而提高獲得堿基編輯株系的概率[18,19]。在部分位點(diǎn)，這些策略同樣能一定程度的富集引導(dǎo)編輯株系。但是可能由于引導(dǎo)編輯器活性低于堿基編輯器，富集策略對(duì)植物引導(dǎo)編輯的幫助遠(yuǎn)低于堿基編輯[13,14]。

3 結(jié)語與展望

2013年以來，盡管植物基因編輯技術(shù)已取得了長足進(jìn)步，但多數(shù)編輯案例是通過靶向突變實(shí)現(xiàn)的。相對(duì)于高效穩(wěn)定的基因組靶向突變工具，植物精準(zhǔn)編輯工具往往在編輯形式或效率上存在明顯缺陷。PPE系統(tǒng)在植物中實(shí)現(xiàn)了其他編輯工具無法完成的多種精準(zhǔn)突變，極大增強(qiáng)了植物基因組編輯能力，使得在植物功能基因組研究和作物定向育種改良廣泛應(yīng)用精準(zhǔn)編輯成為可能。目前，植物引導(dǎo)編輯器在部分基因組位點(diǎn)上還存在效率不足等問題，但這些問題可能從優(yōu)化編輯器表達(dá)條件、篩選或進(jìn)化更加適于植物系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄工具、以及適配pegRNA結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單的CRISPR-Cas系統(tǒng)等角度加以解決。相信隨著編輯條件的持續(xù)優(yōu)化和編輯器系統(tǒng)的反復(fù)迭代，植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)將快速實(shí)用化，為在植物基因組精確編輯技術(shù)的開發(fā)和利用打開新局面。

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Prime editing creates a novel dimension of plant precise genome editing

Ruiying Qin, Pengcheng Wei

The precise genome editing has not been well established in plants, largely because of the limited frequency of homology recombination and the delivery barrier of donor templates. Recently, Dr. Caixia Gao’s group from the Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, developed a series of plant prime editors (PPEs), which mediats the prime editing in the genomes of rice and wheat. The PPE systems are able to generate all 12 kinds of programmable base substitutions, as well desired multiplex nucleotide substitutions and small deletions or insertions without DNA double-strand breaks, thus providing versatile tools for precise plant genome editing. Herein, we introduce the structure and the editing capacity of the PPEs. The attemp on efficiency enhancements of PPEs and other PPEs are also discussed, which may provide a reference for appropriate application of PPEs in plants and also for continuous optimization of the editing tools.

prime editing; precise editing; CRISPR; genome editing; crop

2020-05-02;

2020-05-20

國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)(編號(hào)：2019ZX08010003-001-008，2016ZX08010-002-008)資助[Supported by the Genetically Modified Breeding Major Projects (Nos. 2019ZX08010003-001-008, 2016ZX08010-002-008)]

秦瑞英，碩士，副研究員，研究方向：作物遺傳與育種。E-mail: laorui_1023@163.com

魏鵬程，博士，研究員，研究方向：作物遺傳與育種。E-mail: weipengcheng@gmail.com

10.16288/j.yczz.20-125

2020/5/28 11:48:19

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200528.1039.002.html

(責(zé)任編委: 韓玉波)