蔣向輝，楊永平，譚 榮

（1.凱里學(xué)院，貴州凱里 556011；2.貴州奧特藥業(yè)有限公司，貴州凱里 556011）

靈香草（Lysimachia foenum-graecumHance）系報(bào)春花科珍珠菜屬植物［1］，其味香氣濃，是我國特色的傳統(tǒng)藥用植物，其全草可以作藥用，常用于解熱、治牙痛、活血和驅(qū)蟲.當(dāng)前對有關(guān)靈香草化學(xué)成分的研究相對較少，可能與靈香草揮發(fā)性成分極大有關(guān)，現(xiàn)已分離并鑒定出β-谷甾醇、苯甲醇、棕櫚酸、百里香酚、三萜皂苷、苯乙酮、烯酸乙酯、香荊芥酚、豆衡醇、豆街醇、槲皮素等化合物［2］.大量的研究表明，靈香草中富含黃酮類成分［3］，其中黃酮醇類化合物槲皮素在多種藥材中是抗菌消炎和抗腫瘤的主要成分.但迄今為止對靈香草槲皮素含量的提取分離與測定的研究尚未見報(bào)道.

靈香草萃取物通常采用乙醇或甲醇等有機(jī)溶劑萃取，但以單一有機(jī)溶劑作為萃取物往往收率較低，并且由于靈香草中揮發(fā)性成分較多，在提取過程中導(dǎo)致類黃酮損失較多，限制了靈香草類黃酮的開發(fā)與使用.本研究擬以2 mol/L的鹽酸甲醇溶液為提取溶劑提取靈香草類黃酮，采用HPLC 檢測方法測定靈香草甲醇提取物中槲皮素含量，為靈香草藥材質(zhì)量的檢測和槲皮素的開發(fā)利用提供技術(shù)參考.

1 試驗(yàn)材料

材料采自云南、廣西和貴州省的靈香草產(chǎn)區(qū)，由貴州奧特藥業(yè)有限公司提供（見表1）.

表1 供試樣品來源表

2 試驗(yàn)儀器與試劑

2.1 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)儀器有日本島津LC-30A 型高效液相色譜儀，Wondasil C18反向色譜柱，KQ2200DV超聲波清洗機(jī)，R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，萬能粉碎機(jī)，101A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，BSA224SCW 電子分析天平和UV-8000雙光束紫外可見分光光度計(jì).

2.2 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)用試劑有乙酸乙酯和甲酸（購自懷化新科儀化學(xué)試劑公司，均為色譜純），有機(jī)試劑甲醇、甲苯（購自湖南長沙華騰試劑有限公司），無機(jī)試劑鹽酸、氫氧化鈉等（購自湖南懷化市玻璃儀器化學(xué)試劑有限公司），槲皮素對照品（購自中國藥品生物制品檢定所）.

3 試驗(yàn)方法

3.1 色譜條件選擇

色譜柱采用Wondasil C18 反向色譜柱，通過紫外掃描，檢測發(fā)現(xiàn)槲皮素在波長為375 nm 時(shí)有最大吸收，特將HPLC 檢測的波長設(shè)定為375 nm.通過考察甲苯-乙酸乙酯-甲酸按不同比例混合（10∶6∶4，10∶5∶2和10∶8∶1）對峰形及分離度影響，將槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液HPLC 圖與靈香草鹽酸甲醇提取液HPLC 圖進(jìn)行比較，當(dāng)甲苯-乙酸乙酯-甲酸配比為10∶8∶1 時(shí)保留時(shí)間相對穩(wěn)定，樣品分離明顯（見圖1）.由于槲皮素保留時(shí)間為19 min，時(shí)間相對較長，因此，加大流速為1.5 mL/min，延長檢測時(shí)間到30 min，色譜柱溫度為實(shí)驗(yàn)室溫度（25 ℃）.

圖1 槲皮素對照品（A）與靈香草鹽酸甲醇提取液（B）的色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

3.2.1 對照品溶液的配制

槲皮素對照慢速離心后，稱量5.0 mg，先用35～40 mL濃度為2 mol/L的鹽酸甲醇溶解，再用鹽酸甲醇定容至50 mL，即得100 μg/mL 的槲皮素對照品溶液，再從該容量瓶中分別量取2、3、4、5、6、7、8 mL槲皮素對照品溶液，用鹽酸甲醇定容至10 mL，制得濃度為20、30、40、50、60、70、80μg/mL 的槲皮素對照品溶液.

3.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取靈香草粉末0.5025，0.5050和0.5075 g三份，分別加入250 mL的玻璃圓底燒瓶，再加100 mL的鹽酸甲醇溶液，固定于回流冷凝裝置，調(diào)整溫度到80 ℃，回流加熱1.5 h，冷卻后，迅速減壓抽濾，將濾液置于80 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min，得到約2 mL 鹽酸甲醇溶液，作為供試品溶液備用.

3.2.3 線性關(guān)系的考察

使用注射器量取上述不同濃度的母液1.5 mL，采用0.22μm 有機(jī)相系濾膜過濾，分別置于不同刻度試管中.按3.1得到的色譜條件，進(jìn)行高效液相色譜檢測，測定不同濃度槲皮素的峰面積，采用SPSS19.0 軟件分析槲皮素含量與峰面積之間的線性關(guān)系，得到線性回歸直線方程為y=78257x+43567，并以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），槲皮素的質(zhì)量體積比濃度為橫坐標(biāo)（X），得到線性曲線圖2，從圖中可以看出，當(dāng)槲皮素質(zhì)量體積比濃度在25～75μg/mL時(shí)，濃度與峰面積線性關(guān)系良好.

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 精密度試驗(yàn)

使用注射器吸取濃度為50μg/mL 的槲皮素對照品溶液1.5 mL，按3.1得到的色譜條件，進(jìn)行高效液相色譜檢測，測定不同濃度槲皮素的峰面積，共得6 組數(shù)據(jù)（n=6），最后數(shù)據(jù)及其處理結(jié)果如表2所示.從表2 可以看出，槲皮素峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差與計(jì)算結(jié)果算術(shù)平均值的比值，即相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.83%，小于2.0%，表明該高效液相色譜儀精密度較好.

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

使用注射器分別吸取上述3.2.2所制備的供試品溶液1.5 mL，按3.1得到的色譜條件，進(jìn)行高效液相色譜檢測，測定不同濃度槲皮素的峰面積，共得6組數(shù)據(jù)（n=6），最后數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表3所示.從表3可以看出，供試品峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.18 %（＜2.0 %），表明樣品制備過程穩(wěn)定、成分變化小，制備方法重復(fù)性好，用于測定槲皮素含量數(shù)據(jù)可靠.

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述3.2.2法制備出槲皮素供試品溶液后，用移液器量取供試品溶液1.5 mL，并通過0.22μm有機(jī)相系濾膜過濾，分別于0，2，4，6，8，10 h等6個(gè)時(shí)間段進(jìn)行，進(jìn)樣穩(wěn)定性檢測，最后檢測數(shù)據(jù)及其處理如表4中所示.從表4可以看出，槲皮素供試品峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為2.17%，小于2.5%，表明槲皮素在10 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，含量變化小，該檢測的方法可靠.

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取靈香草（LXIlfg01）粉末2份，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量為0.5 025，0.5 104，0.5 003，0.5 163，0.5 107和0.4 933 g，按照上述3.3法制備6組槲皮素含量已知的靈香草供試品溶液，再分別向6 組供試品溶液加入1.8、2.0、2.2、1.8、2.0和2.2 mL濃度為100μg/mL的槲皮素對照品溶液，即分別加入18、20、22、18、20 和22μg 的槲皮素對照品，即得到6 組不同的加有不同量對照品的用于加樣回收檢測的供試品溶液.按3.1 所設(shè)定的HPLC色譜條件，參照3.2.3項(xiàng)方法測定不同樣品中槲皮素的峰面積，標(biāo)測混合后槲皮素檢測量，共得6 組數(shù)據(jù)（n=6），計(jì)算供試溶液中加入標(biāo)品后的加樣回收率.其數(shù)據(jù)及其處理結(jié)果如表5所示.

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

由表中數(shù)據(jù)得出：槲皮素的加樣回收率為96.44%，在所規(guī)定范圍93.45%～100.75%內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.49%，未超過規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（5%），即該方法較準(zhǔn)確.

4 含量測定結(jié)果與分析

4.1 提取液峰面積測定

準(zhǔn)確稱取7個(gè)不同來源的靈香草樣品0.5 025、0.5 050、0.5 075 g，按上述3.2.2 法制備出靈香草供試品溶液后，用注射器吸取供試品溶液1.5 mL，參照3.2.3 項(xiàng)方法用進(jìn)樣針精密吸取20 μL，根據(jù)3.1設(shè)定的色譜條件測定樣品槲皮素含量，最后數(shù)據(jù)如下表6所示.

表6 各產(chǎn)地靈香草中槲皮素的含量

續(xù)表6 各產(chǎn)地靈香草中槲皮素的含量

4.2 提取液中槲皮素濃度的計(jì)算

根據(jù)3.2.3得到的線性方程y=36 402x+58 412，可變換為x=（y-58 412）/36 402，根據(jù)峰面程計(jì)算得各產(chǎn)地靈香草中槲皮素的含量，計(jì)算結(jié)果如表6所示.由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得出，各批次靈香草中都含有較多的槲皮素，以來自廣西來賓（LXIlfg04）的靈香草槲皮素含量相對較高，為0.723 mg/g，以來自貴州興義市（LXIlfg01）的靈香草槲皮素含量相對較低，為0.443 mg/g.

5 小結(jié)與討論

本研究為了測定靈香草中槲皮素含量，對靈香草槲皮素的提取液進(jìn)行了摸索，找到了提取率較高的鹽酸甲醇混合提取溶劑.由于槲皮素極性較蘆丁小，本研究采用反向色譜柱時(shí)，適當(dāng)加大流速到1.5 mL/min，保留時(shí)間19 min 時(shí)，槲皮素能得到較好的分離；通過流動相甲苯、乙酸乙酯和甲酸的不同配比的篩選，找到了能有效分離靈香草槲皮素的理想配比，即甲苯：乙酸乙酯：甲酸=10∶8∶1；通過最大吸收波長分析，找到了槲皮素的紫外檢測最大吸收波長為375 nm；以槲皮素保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行槲皮素定性與定量分析，峰面積與含量絕對相關(guān)系數(shù)是0.9998，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）變化范圍為1.83%～2.49%，加樣回收率平均為96.44%，表明采用HPLC 法檢測靈香草甲醇提取物中槲皮素含量靈敏度高、可重復(fù)性好，本研究為靈香草藥材成分的開發(fā)利用提供了較好的參考.

本實(shí)驗(yàn)對槲皮素的提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，劉少靜等［4］以55%的乙醇溶液為提取液，測得沙棘果粉中槲皮素含量為0.128 mg/mL，王珍等［5］以70% 的乙醇為提取液，測得山楂中槲皮素含量為0.664 mg/mL，本研究選用鹽酸甲醇的混合溶液為提取液，再通過回流提取后得到靈香草中槲皮素含量最高為0.723mg/mL.在本研究中靈香草槲皮素色譜峰保留時(shí)間較長，但能將槲皮素從類黃酮中較好地分離出來，這為今后從其它藥材中分離槲皮素類黃酮提供了較好的參考.