昌毓穗

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，南昌 330006)

食管癌是一常見的人類惡性腫瘤[1]。全球食管癌患者5年生存率為15%～20%[2-3]。我國食管癌的發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平，且存在城鄉(xiāng)和性別差異[4]。我國食管癌的組織病理類型仍以鱗狀細(xì)胞癌占絕大多數(shù)[5]。很多食管癌患者就診于晚期并且預(yù)后較差[6]。盡管化療作為腫瘤手術(shù)切除治療后的輔助治療方法及晚期食管癌姑息治療方法并已在臨床上廣泛應(yīng)用，但由于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性而嚴(yán)重影響臨床化療效果，且化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞沒有選擇性的作用，容易導(dǎo)致機(jī)體各種臟器損傷，常易使患者難以耐受。因此，對(duì)于抗腫瘤新藥物及療效的研究顯得很有必要[2,7]。

近年來發(fā)現(xiàn)作為內(nèi)源性激素的心鈉素(ANP)在胰腺癌、肺癌、乳腺癌等實(shí)體瘤中具有抗癌作用[8]，且無化療藥物所致的心臟毒性、骨髓抑制及肝腎損害等副作用；另一顯著特點(diǎn)是，ANP作為內(nèi)源性激素在超過生理劑量時(shí)對(duì)人體正常細(xì)胞并無損傷作用[9-10],且食管組織上也存在ANP受體[11]。為探討ANP對(duì)食管鱗癌的抗腫瘤效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)選用食管鱗癌細(xì)胞Eca109，通過不同干預(yù)措施來研究ANP對(duì)食管鱗癌增殖及侵襲性的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與分組

RPMI 1640(北京索萊寶科技有限公司)，胎牛血清(美國Gibico公司)，3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)(MTT，美國Sigma公司)，人alpha-心鈉素(美國Phoenix Pharmaceuticals公司)，8-溴環(huán)磷酸鳥苷(cGMP，美國Sigma公司)，cGMP抗體(美國Sigma公司)，基質(zhì)膠(Matrigel Matrix，美國BD公司)，Transwell小室(美國Sigma公司)，RIPA裂解液(南京諾唯贊生物科技有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，兔抗Ras抗體(美國Millipore公司)，鼠抗β-actin單克隆抗體(美國ANBO公司)。食管鱗癌細(xì)胞株Eca109購買于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。本實(shí)驗(yàn)完成于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研中心。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為12組：對(duì)照組(Control組)，AB組(cGMP抗體濃度為1:80滴度稀釋)，ANP10組、ANP1組、ANP0.1組、ANP0.01組(ANP濃度分別為10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)，cGMP10組、cGMP1組、cGMP0.1組、cGMP0.01組(cGMP濃度分別為10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)，ANP1+AB(anti-body,AB)組(ANP濃度為1 μmol·L-1，cGMP抗體濃度為1:80滴度稀釋)，cGMP1+AB組(cGMP濃度為1 μmol·L-1，cGMP抗體濃度為1:80滴度稀釋)。各組均進(jìn)行增殖和侵襲實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)Control、AB、ANP1、ANP0.1、ANP0.01、ANP1+AB組Ras蛋白的表達(dá)。

1.2 MTT法測(cè)定

采用MTT法測(cè)定心鈉素抗食管鱗癌細(xì)胞增殖效應(yīng)。取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的良好食管鱗癌細(xì)胞Eca109，將細(xì)胞懸液進(jìn)行染色計(jì)數(shù)并將活細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104個(gè)·mL-1。分別接種于96孔板，并于每板設(shè)置空白對(duì)照孔，只加培養(yǎng)基。放入37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。于第7天行MTT法測(cè)定。

1.3 Transwell法檢測(cè)

采用Transwell法檢測(cè)心鈉素抗食管鱗癌細(xì)胞侵襲性。于不同組的Transwell小室中各加入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的食管鱗癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞懸液，然后在小室中依據(jù)組別而加入各種濃度的藥物試劑。37 ℃，5%CO2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡(×200)下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞。

1.4 Western Bloting檢測(cè)

采用Western Bloting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。裂解并提取每組細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定各組細(xì)胞總蛋白濃度。蛋白變性后上樣，再于PAGE膠上電泳，轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色，再用TBST漂洗。5%脫脂奶粉封閉液中室溫下封閉1 h。用Ras蛋白、β-actin一抗4 ℃輕搖孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次，每次20 min。結(jié)合二抗后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白質(zhì)。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析(ANOVA)及方差齊性分析分別進(jìn)行各組間的比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANP對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響

4種不同濃度ANP組(ANP10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)和cGMP組(cGMP10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)較其他4組(Control、ANP1+AB、cGMP1+AB、AB組)食管鱗癌細(xì)胞增殖均明顯減弱(P<0.05)。且其他4組間食管鱗癌細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 ANP對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲力的影響

4種不同濃度ANP組(ANP10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)和cGMP組(cGMP10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)較其他4組(Control、ANP1+AB、cGMP1+AB、AB組)食管鱗癌細(xì)胞侵襲力均明顯減弱(P<0.05)，且其他4組間食管鱗癌細(xì)胞侵襲力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 ANP對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Ras蛋白表達(dá)的影響

ANP1和ANP0.1組Ras蛋白的表達(dá)較其他4組(Control、AB、ANP0.01、ANP1+AB組)下降(P<0.05)，且其他4組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

*間比較P>0.05，#間比較P>0.05,*與#比較P<0.05,&與*或#比較P>0.05。

圖3 ANP對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Ras蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近來食管癌成為全球第七位常見腫瘤及第六位腫瘤致死性疾病[12]。我國是世界范圍內(nèi)食管癌高發(fā)地區(qū)之一，約占全球大概一半左右的病例[13]。選取食管鱗癌細(xì)胞作為研究的腫瘤細(xì)胞，具有較大和普遍的意義。

MTT法具有較高敏感性和可靠性[14]。本研究結(jié)果顯示，ANP能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，具有抑癌作用。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的又一個(gè)重要惡性生物學(xué)特征。腫瘤細(xì)胞浸潤周圍組織及轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，涉及到一系列分子和細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用[15]。其中重要的步驟之一就是先降解周圍組織的細(xì)胞外基質(zhì)。BD Matrigel膠的基質(zhì)是從富含細(xì)胞外基質(zhì)的engelbreth-holm-swarm(EHS)鼠肉瘤中提取出來的，成分與人體細(xì)胞外基質(zhì)相類似，是腫瘤侵襲性研究的基本物質(zhì)，能很好地模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的惡性生物學(xué)行為過程。本文結(jié)果表明，不同濃度的心鈉素能降低食管癌細(xì)胞的遷移，從而抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲力。

研發(fā)腫瘤靶向治療藥物已成為提高腫瘤患者生存率的一個(gè)受關(guān)注的研究方向[7]。ANP是主要由心房細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性活性激素肽，高于生理劑量的ANP對(duì)肺癌等多種腫瘤具有較明顯的抗腫瘤作用，并且對(duì)正常細(xì)胞卻沒有明顯的毒副作用[8-9]。這使得ANP成為一種很有開發(fā)前景的抗腫瘤藥物。

8-溴環(huán)磷酸鳥苷是cGMP的類似衍生物，具有良好的細(xì)胞通透特性，能較好地進(jìn)入細(xì)胞，從而模擬cGMP的作用，因此被用于多種腫瘤的研究中[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ANP和cGMP對(duì)食管鱗癌細(xì)胞都具有抗腫瘤作用，能抑制其增殖和侵襲力。但當(dāng)cGMP抗體與ANP或與cGMP一起時(shí)，對(duì)兩者的抗腫瘤作用均可起到對(duì)抗作用；同時(shí)，cGMP抗體自身對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲力無影響。而cGMP抗體是cGMP的特異性抗體，在體內(nèi)僅與cGMP相作用，因此推斷，cGMP抗體對(duì)抗ANP的抗腫瘤效應(yīng)是拮抗細(xì)胞內(nèi)cGMP的結(jié)果，ANP對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲力的抑制作用是由cGMP介導(dǎo)的。

本文蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度ANP對(duì)Ras蛋白均有抑制作用；當(dāng)ANP加cGMP抗體一起作用于食管鱗癌細(xì)胞時(shí)，這種對(duì)Ras的抑制作用消失；同時(shí)，單獨(dú)用cGMP抗體時(shí)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中的Ras蛋白無抑制作用。由于cGMP抗體是cGMP的特異性抗體，可阻斷cGMP的生物學(xué)作用，由此可推論，在cGMP抗體與ANP一起時(shí)，由于cGMP抗體阻斷了ANP上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中cGMP的效應(yīng)，從而導(dǎo)致ANP對(duì)Ras蛋白表達(dá)的抑制作用消失。因此，ANP通過cGMP介導(dǎo)而抑制Ras蛋白的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生抗癌作用。

總之，ANP通過cGMP介導(dǎo)抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲力，并下調(diào)食管鱗癌中Ras的表達(dá),從而產(chǎn)生拮抗食管鱗癌作用。