趙振宇

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,長沙 410000)

microRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA[1]，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)端位點(diǎn)相結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其蛋白翻譯[2]。近年來miRNA調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)逐漸成為研究熱門，多種miRNA參與了膿毒癥的病理生理過程中，如miRNA-147、miRNA-155、miRNA-9、miRNA-346、let-7、miRNA-98、miRNA-142-3p等[3]。miR-33靶向結(jié)合ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)，參與脂質(zhì)代謝，但是有關(guān)免疫炎癥的研究甚少[4-5]。有研究[6-8]表明，miR-33是脂多糖誘導(dǎo)單核細(xì)胞炎癥模型中表達(dá)變化明顯的miRNAs之一，提示miR-33可能參與了細(xì)胞炎癥反應(yīng)調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)使用miRNA靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)人核受體相互作用蛋白1(NRIP1)可能是miR-33潛在靶點(diǎn)。為了明確miR-33在細(xì)胞炎癥中的生物學(xué)功能，本研究改變?nèi)藛魏思?xì)胞(THP-1)巨噬細(xì)胞miR-33表達(dá)水平，觀察THP-1細(xì)胞NRIP1蛋白表達(dá)以及THP-1細(xì)胞炎癥因子分泌變化來研究其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

THP-1(中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)；脂多糖(美國Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；miR-33 mimics、miR-33 inhibitor(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；TransIT-X2?Dynamic Delivery System轉(zhuǎn)染試劑(美國Mirus公司)；NRIP1抗體、β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；Human ELISA試劑盒 TNF-α、IL-6(深圳欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

THP-1培養(yǎng)及傳代方法：將細(xì)胞密度為5×105mL-1的THP-1細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳至第3—6代。隨機(jī)分組：1)空白對(duì)照組(等量磷酸鹽緩沖液)；2)miR-33 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)照組(轉(zhuǎn)染模擬miR-33 mimics)；3)miR-33 mimics轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染miR-33 mimics)；4)miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)照組(轉(zhuǎn)染模擬miR-33 inhibitor)；5)miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染miR-33 inhibitor)。各組細(xì)胞加入10.0 ng·mL-1LPS刺激細(xì)胞24 h。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞混勻，在6孔板中鋪混勻的細(xì)胞懸液，密度為106mL-1，總轉(zhuǎn)染體系為2 mL。按照miRNA轉(zhuǎn)染試劑TransIT-X2?Dynamic Delivery System操作說明轉(zhuǎn)染，各板孔miRNA最終濃度為25 nmol·L-1。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量

采用PCR法檢測miR-33的表達(dá)：將細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，TRIzol法提取總RNA，然后定量，測定總RNA純度。按照Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒操作說明獲得cDNA。熒光定量PCR儀擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，確保擴(kuò)增準(zhǔn)確性和專一性，Ct值表示樣品模板相對(duì)含量。樣本均采用了復(fù)孔。miR-33 PCR的擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s和60 ℃ 32 s，循環(huán)40次。引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。獲得Ct值后，應(yīng)用比較Ct法進(jìn)行相對(duì)定量，目標(biāo)基因相對(duì)定量用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.5 Western Blot檢測NRIP1蛋白表達(dá)

按照全細(xì)胞裂解液說明書提取各組細(xì)胞總蛋白并測定濃度，蛋白變性，用SDS-PAGE法電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，搖床，封閉1 h，漂洗，加入NRIP1單克隆抗體(1:800)溫度4 ℃孵育過夜。次日取出PVDF膜，漂洗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:5000),孵育1 h，然后漂洗。ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，凝膠分析系統(tǒng)分析判斷NRIP1蛋白的表達(dá)情況。

1.6 ELISA法檢測TNF-α、IL-6的表達(dá)

使用Human TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TNF-α、IL-6釋放量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miRNA-33細(xì)胞中表達(dá)變化

miR-33相對(duì)表達(dá)量：空白對(duì)照組為361.00±84.73，miR-33 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)照組為432.86±77.86,miR-33 mimics轉(zhuǎn)染組為215 915.64±16 823.75，miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)照組為287.97±16.05，miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染組為10.38±1.58。各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表示轉(zhuǎn)染成功。

2.2 Western blot檢測細(xì)胞NRIP1的蛋白表達(dá)

miR-33 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞NRIP1蛋白含量灰度值為0.81±0.12，miR-33 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞NRIP1蛋白含量灰度值為0.49±0.08，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，顯示miR-33下調(diào)NRIP1蛋白表達(dá)水平。見圖1。

miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞NRIP1蛋白含量灰度值為0.44±0.09，miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞NRIP1蛋白含量灰度值為0.72±0.11，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，顯示miR-33 inhibitor上調(diào)NRIP1蛋白表達(dá)水平。見圖2。

因此，本實(shí)驗(yàn)從正反兩方面驗(yàn)證：miR-33負(fù)性調(diào)控THP-1細(xì)胞NRIP1蛋白表達(dá)。

2.3 miR-33對(duì)THP-1細(xì)胞釋放炎癥因子的影響

在10.0 ng·mL-1LPS刺激下，miR-33 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞TNF-α釋放量為689.536±36.368、IL-6釋放量為39.201±3.191，miR-33 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TNF-α釋放量為417.575±22.862、IL-6釋放量為6.961±1.821，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，顯示miR-33抑制TNF-α和IL-6表達(dá)。見圖3。

在10.0 ng·mL-1LPS刺激下，miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞TNF-α釋放量為580.082±19.765、IL-6釋放量為136.011±15.287，miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TNF-α釋放量為836.896±21.956、IL-6釋放量為219.865±16.865，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，顯示miR-33 inhibitor促進(jìn)TNF-α和IL-6表達(dá)。見圖4。

因此，本實(shí)驗(yàn)從正反兩方面驗(yàn)證：miR-33負(fù)性調(diào)控THP-1細(xì)胞炎癥應(yīng)答。

3 討論

miRNA廣泛參與了生物體內(nèi)細(xì)胞增殖分化、免疫調(diào)控、物質(zhì)代謝以及生長發(fā)育等各方面的病理生理過程，近年來已成為分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等各學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。眾多miRNAs參與了機(jī)體肺部炎癥疾病的調(diào)控：miRNA-126和miRNA-21參與調(diào)節(jié)氣道過敏性炎癥；miRNA-199a-5p和miRNA-34a能夠促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生發(fā)展；miRNA-155和miRNA-146a能夠減輕急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)肺部炎癥反應(yīng)[9-10]。雖然miRNA-33有關(guān)免疫炎癥方面研究報(bào)道較少，但是與炎癥關(guān)系緊密[11-12]。

LPS通過與細(xì)胞膜上Toll樣受體4(TLR4)相結(jié)合，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)釋放產(chǎn)生“瀑布效應(yīng)”[13]。TNF-α和IL-1β是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)(inflammatory cascade)快速啟動(dòng)因子，在4～6 h表達(dá)達(dá)到高峰，是啟動(dòng)“瀑布效應(yīng)”最上游的細(xì)胞炎癥因子，一定程度上反映了病情嚴(yán)重程度以及預(yù)后[14]。本實(shí)驗(yàn)通過功能獲得/缺失實(shí)驗(yàn)(gain-and loss-of-function studies)，將miR-33 mimics和miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，檢測TNF-α和IL-6表達(dá)變化，探討了miR-33調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究證明，在LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，miR-33與炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，表明miR-33負(fù)性調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。

多種Toll樣受體配體可以激活巨噬細(xì)胞NRIP1以及下游NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起大量炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1β等釋放[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-33 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-33表達(dá)上調(diào)，能夠抑制NRIP1蛋白表達(dá)；而miR-33 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-33表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)NRIP1蛋白表達(dá)。這表明miR-33通過靶向NRIP1，抑制下游相關(guān)NF-κB炎癥信號(hào)通路，負(fù)性調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，在調(diào)控膿毒癥炎癥反應(yīng)上發(fā)揮著重要作用[18-19]。miR-33可以抑制炎癥“瀑布效應(yīng)”啟動(dòng)因子，從上游調(diào)控炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制膿毒癥的進(jìn)展。進(jìn)一步探究miR-33負(fù)向調(diào)控炎癥相關(guān)靶基因，有望為診斷和治療膿毒癥提供新線索[20]。