李 嫻，邢亞東，李姍姍，劉 浩

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，現(xiàn)代被譽(yù)為“四大懷藥”之一。生地黃經(jīng)不同炮制方法，加工成熟地黃后，其藥性由寒轉(zhuǎn)溫，味由苦轉(zhuǎn)甘，功效由清轉(zhuǎn)補(bǔ)，具有補(bǔ)血滋陰、益精填髓的功效[1]。熟地黃臨床應(yīng)用廣泛，屬于高配方頻度中藥之一。然而因其味甘而膩，易于助濕生滿，有礙脾胃消化吸收，病人服用后，會出現(xiàn)滋膩礙胃的現(xiàn)象，即胃納欠佳、腹脹、便溏等反應(yīng)[2]。明代李時珍在《本草綱目》首次記載用酒和砂仁炮制地黃，指出因熟地黃質(zhì)厚味濃，滋膩礙脾，酒制后其性轉(zhuǎn)溫，主補(bǔ)陰血，并可借酒力行散，起到行藥勢、通血脈的作用，同時借助砂仁香竄之性，合和五臟沖合之氣，歸宿丹田。

目前熟地黃常用的炮制方法有2015版《中國藥典》中收錄的清蒸法和酒燉法，這兩種炮制方法中均未加入辛香類藥物。2005版《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》中收錄的九蒸九曬法，加入了砂仁。因此，本實驗分別選用清蒸法、酒燉法和九蒸九曬法3種方法炮制的熟地黃為供試品，通過建立HPLC法同時測定熟地黃中梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-羥甲基糠醛(5-HMF)7種化學(xué)成分含量，考察不同炮制方法對熟地黃主要化學(xué)成分的影響，以期為熟地黃臨床應(yīng)用和綜合開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 賽默飛UltiMate3000型高相液相色譜儀(美國賽默飛科技公司，配置在線脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、DAD檢測器)，賽默飛色譜工作站(美國賽默飛科技公司)；KQ-600KDE1超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司；XS105分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；FW100粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑與樣品 梓醇(中國食品藥品檢定研究院，批號：110808-201711，純度99.6%)，益母草苷(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號：YA220607，純度≥98%)，地黃苷A(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號：DR192237，純度≥98%)，地黃苷D(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號：DR210025，純度≥98%)，毛蕊花糖苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111530-201713，純度92.5%)，異毛蕊花糖苷(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號：YI3306019，純度≥98%)，5-HMF(中國食品藥品檢定研究院，批號：111626-201711，純度99.4%)，甲醇、乙腈為色譜純(美國天地有限公司)，磷酸為分析純(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，水為娃哈哈純凈水。

黃酒(中國紹興黃酒集團(tuán)有限公司，生產(chǎn)批號：20170627，酒精度15%)；地黃Rehmanniae Radix(產(chǎn)地河南)、砂仁Amomi Fructus(產(chǎn)地廣東)，均購自蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院王迪生副教授鑒定，符合《中國藥典》2015年版要求[5]。

1.3 HPLC色譜條件 色譜柱：賽默飛C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，程序為：0～8 min，1%B；8～9 min，1%～4%B；9～25 min，4%B；25～35 min，4%～20%B；35～50 min，20%B；50～50.01 min，20%～1%B；50.01～55 min，1%B。柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm、332 nm，波長切換：0.00～29.00 min，波長203 nm，29.01～55.00 min，332 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

1.4 供試品的制備

1.4.1 清蒸熟地黃的制備 取生地黃，蒸制12 h，悶12 h后，上下翻動1次，如此反復(fù)蒸悶2次，70 ℃干燥至熟地黃飲片的含水量≤15.0%時取出，放涼即得[3]。

1.4.2 酒燉熟地黃的制備 取生地黃，加入黃酒拌勻，每100 kg生地黃用黃酒40 kg[3]，悶潤至酒吸盡，連續(xù)燉制48 h后(燉制24 h時，上下翻動1次)，70 ℃干燥至熟地黃飲片的含水量≤15.0%時取出，放涼即得。

1.4.3 九蒸九曬熟地黃的制備 取生地黃，加黃酒適量拌勻一段時間后悶潤至酒吸盡，以武火加熱，用容器收集流出的熟地黃汁，蒸約48 h至地黃中央發(fā)虛為度，取出，曬1 d；再拌入熟地黃汁和黃酒，再蒸24 h，取出再曬1 d；如此反復(fù)，蒸曬8次。至第9次，將黃酒與砂仁粉一起拌入，蒸24 h，以蒸至內(nèi)外漆黑，味甜酸無苦味為度，取出即得。每100 kg生地黃用黃酒50 kg、砂仁粉0.9 kg[4]。

1.5 對照品儲備液的制備 分別取梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF對照品適量，精密稱定，加入甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為2.189 2、2.165 8、2.035 0、3.557 4、2.244 2、2.016 8、2.062 6 mg/mL的混合對照品儲備液。

1.6 供試品溶液的制備 取生地黃、清蒸熟地黃、酒燉熟地黃、九蒸九曬熟地黃經(jīng)粉碎(過4號篩)所得的粉末約2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，精密稱重，30 ℃水溫超聲處理40 min，過濾，放冷，補(bǔ)重，精密量取濾液25 mL，水浴蒸干，殘渣加10%乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并定容，備用。

1.7 系統(tǒng)適用性 分別取混合對照品溶液和供試品溶液，按“1.3 HPLC色譜條件”進(jìn)樣分析，各色譜峰的拖尾因子均在0.95～1.05之間，與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF的理論塔板數(shù)均大于6 800。

2 結(jié)果

2.1 HPLC定量方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性 通過比較空白溶液、對照品溶液和供試品溶液的色譜圖考察專屬性。結(jié)果表明，供試品溶液中其他成分對待測成分無干擾，分析方法專屬性良好，色譜圖見圖1～3。

2.1.2 檢測限與定量限 取各對照品溶液適量，加入甲醇溶液逐步稀釋，以信噪比3時對應(yīng)待測物濃度為檢測限，以信噪比10時對應(yīng)待測物濃度為定量限進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 各對照品的檢出限和定量限

2.1.3 線性與范圍 分別精密量取梓醇、異毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、5-HMF對照品儲備液適量置5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得濃度分別為271.46、12.99、40.70、711.48、224.42、806.74、309.38 μg/mL的混合對照品工作液。按高效液相色譜條件分別精密吸取混合對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5 μL，依法測定，記錄色譜峰的峰面積，以各對照品濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸計算，結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系

2.1.4 精密度 精密吸取對照品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣6次，每次5 μL，測得梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF峰面積RSD分別為0.41、0.67、1.14、1.88、0.33、1.71、0.46，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品溶液，在色譜條件下分別于0、1、3、5、12、24 h測定，測得梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF峰面積RSD分別為0.38、0.94、1.19、0.94、0.70、0.90、0.45，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性 取清蒸熟地黃，按1.6方法平行制備供試品溶液6份，在色譜條件下，測得毛梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF峰面積RSD分別為0.81、0.85、1.36、1.36、0.67、1.22、0.42，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率 精密稱取清蒸熟地黃粉末9份，每份1 g，精密秤定，精密加入對照品適量。按“1.6”項下方法制備供試品溶液，在色譜條件下，測得梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF平均加樣回收率RSD分別為1.51、1.14、1.14、0.84、1.44、1.23、1.28。

2.2 樣品含量測定 取生地黃、清蒸熟地黃、酒燉熟地黃、九蒸九曬熟地黃各約2 g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”項下操作，制備供試品溶液，按“高效液相色譜條件”進(jìn)樣5 μL，測定峰面積，采用外標(biāo)法對梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF的含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果(n=3)

3 討論

本實驗首次建立了同時測定熟地黃中梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、5-HMF含量的HPLC方法。測定了熟地黃3種不同炮制品，即清蒸熟地黃、酒燉熟地黃、九蒸九曬熟地黃中以梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D為主的環(huán)烯醚萜苷類成分，以毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷為主的苯丙素苷類成分，以及5-HMF的含量。實驗預(yù)試中，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，5-HMF的提取方法主要有水浴回流提取和超聲提取兩種方法[5]?？紤]到回流提取的加熱過程中，可能會使熟地黃中的多糖自身發(fā)生水解、脫水反應(yīng)生成5-HMF，導(dǎo)致5-HMF含量偏高，實驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。故本實驗采用超聲提取方法，制備供試品溶液。

本實驗結(jié)果顯示，生地黃中不含5-HMF。清蒸熟地黃和酒燉熟地黃中，環(huán)烯醚萜單糖苷梓醇和益母草苷幾乎全部降解；環(huán)烯醚萜雙糖苷地黃苷A、地黃苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量較生地黃中含量降低；可以檢測到5-HMF。九蒸九曬熟地黃中環(huán)烯醚萜單糖苷梓醇和益母草苷、環(huán)烯醚萜雙糖苷地黃苷A、地黃苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷幾乎全部降解；可以檢測到5-HMF。

通過實驗數(shù)據(jù)分析可知，由于梓醇和益母草苷都是環(huán)烯醚萜單糖苷，熱穩(wěn)定較差，地黃經(jīng)過清蒸、酒燉和九蒸九曬加熱過程后，其含量降低至幾乎全部降解。地黃苷A和地黃苷D是環(huán)烯醚萜雙糖苷，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷屬于苯丙素苷，均相對穩(wěn)定，在清蒸熟地黃和酒燉熟地黃中均可以檢測到，但較生地黃含量下降。可能因為毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為咖啡酸酯，在炮制過程中發(fā)生酯鍵的斷裂，從而生成咖啡酸[6]。而九蒸九曬熟地黃蒸曬次數(shù)較多，上述成分幾乎全部降解。地黃在清蒸、酒燉和九蒸九曬過程中發(fā)生了Maillard 反應(yīng)，生成了5-HMF。5-HMF在含糖中藥的炮制過程中都有可能生成，與炮制時間和溫度密切相關(guān)，現(xiàn)已成為中藥炮制原理研究的活性成分，具有抗心肌缺血、抗氧化、降血糖、改變血液流變性和神經(jīng)保護(hù)性作用[5]。

綜上，通過測定熟地黃3種不同炮制品中7種化學(xué)成分的含量，可知不同炮制方法對熟地黃成分的影響較大，尤其是九蒸九曬熟地黃在反復(fù)蒸曬過程中苷類逐漸降解，其生成何種化合物，與九蒸九曬熟地黃增效袪膩藥效變化是否有關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。