胡世豐，雷 春，施 煒，查 誠

結直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，隨著國人生活習慣的改變，結直腸癌的發(fā)病率呈逐年增高趨勢[1-3]。目前，結直腸癌的治療以手術為主，輔以化療、放療、免疫治療等綜合治療，盡管取得很好的效果，仍然有相當一部分病人出現(xiàn)轉移。臨床上亟需了解結直腸癌轉移的分子機制，以期提高早期診斷率和病人的生存率[4-6]。

長鏈非編碼RNA(long chain noncoding RNA,Lnc RNA)是一類長度>200個核苷酸的非編碼RNA[7]。研究[8]表明，LncRNA在表觀遺傳、轉錄、轉錄后等多個層面調控基因的表達。在腫瘤發(fā)生中，LncRNA在多層面尤其在轉錄調控方面影響細胞的正常功能，引起細胞的增殖、轉移、分化異常[9]。LncRNA在癌基因的調控方面發(fā)揮重要作用，其表達的失控可引起腫瘤的增殖、侵襲、凋亡異常[10]。LOEWER等[11]在2010年報道了一種能調節(jié)已經分化的細胞轉換為多能誘導干細胞重編程過程的LncRNA，并將這該RNA命名為LncRNA-ROR(regulator of reprogramming，ROR),以下簡稱為ROR。ROR不僅能調控細胞的重編程過程，其在多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡中發(fā)揮重要作用并與病人預后密切相關[12-13]。但是LncRNA-ROR在結直腸癌轉移中的作用尚欠充分研究。在前期發(fā)表的研究中，我們發(fā)現(xiàn)ROR在癌組織中的表達相比于癌旁組織有明顯降低，臨床病理資料顯示ROR的表達與病人的TNM分期有關，qRT-PCR檢測證實SW620中的ROR表達增加，其高表達導致SW620增殖能力的下降。為了進一步了解ROR在結直腸癌中的作用，我們采用侵襲、遷移、劃痕實驗研究ROR在結直腸癌細胞遷移中的作用?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及轉染、計數(shù) 結直腸癌細胞SW620用含10%FBS的1640培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，選對數(shù)生長期的細胞，將合成的含ROR的慢病毒滴入培養(yǎng)液中，24 h后換液，qRT-PCR檢測轉染效果，獲得穩(wěn)轉細胞株后行后續(xù)實驗。穩(wěn)轉細胞SW620/Vector、SW620/ROR用含10%FBS 的1640 培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。用無血清培養(yǎng)液把細胞懸浮并稀釋至10 mL左右，取1 mL 的細胞懸液加入1 mL 的0.4%的臺盼藍染液。混勻后滴入血球計數(shù)板上，計數(shù)。

1.2 遷移實驗 取對數(shù)生長期的細胞，吸去培養(yǎng)液后無血清培養(yǎng)液饑餓處理8 h。用胰酶消化細胞后，將細胞濃度調整成1×105/mL，在小室的下室加入500 μL含10%血清的培養(yǎng)液，上室加入200 μL細胞懸液。置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，用鑷子取出小室，吸去上室中培養(yǎng)液，用棉棒擦拭小室的上室內面后將上室放入用甲醇配置的0.1%結晶紫染液固定、染色30 min。PBS液漂洗兩次后在倒置顯微鏡下觀察、拍照、計數(shù)。

1.3 侵襲實驗 取對數(shù)生長期的細胞無血清培養(yǎng)液饑餓處理8 h。Matrigel膠放到4 ℃冰箱中過夜，在冰上將無血清培養(yǎng)液與Matrigel膠按5∶1比例混合，取24孔板，每孔加入50 μL稀釋后的Matrigel膠，37 ℃培養(yǎng)箱重放置30 min。將細胞濃度調整成1×105/mL，在小室的下室加入500 μL含10%血清的培養(yǎng)液，上室加入200 μL細胞懸液。置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，用鑷子取出小室，擦拭小室的上室內面后將上室放入用甲醇配置的0.1%結晶紫染液固定、染色30 min。PBS液漂洗后在倒置顯微鏡下觀察、拍照、計數(shù)。

1.4 劃痕實驗 取對數(shù)生長期結直腸癌細胞，PBS緩沖液漂洗兩次后，胰酶消化，吸去胰酶后用含10%血清的培養(yǎng)液懸浮細胞，將懸浮細胞按5×105/孔接種于6孔板中，對照組和實驗組均設3個復孔。次日將細胞換液，20 μL的黃槍頭及尺子進行高于蒸汽滅菌處理。待細胞長滿時用黃槍頭進行劃痕，用PBS緩沖液漂洗細胞3次洗去劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)液。拍照后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h用PBS緩沖液漂洗細胞3次，去除漂起來的細胞，加入無血清培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下拍照。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗。

2 結果

2.1 ROR導致結直腸癌細胞的遷移及侵襲能力降低 SW620細胞在ROR過表達后，穿過人工膜的細胞數(shù)減少(P<0.01)；Transwell侵襲實驗結果表明過表達ROR 后，結直腸癌細胞的侵襲能力減弱(P<0.01)(見表1、圖1)。

表1 2組結直腸癌細胞的遷移及侵襲能力比較

2.2 ROR抑制結直腸癌細胞的劃痕愈合 在同樣的初始劃痕距離下，經過48 h的培養(yǎng)后，相比于空載體對照組，ROR過表達SW620細胞間間距較大(P<0.01)(見表2、圖2)。

分組n0h細胞間距48h細胞間距SW620-Vector330.03±1.224.20±1.07SW620-ROR329.23±1.569.67±1.72t—0.974.68P—>0.05<0.01

3 討論

高通量測序技術證明人類基因組有約98%為非編碼基因，LncRNA占其中的80%[14]。LncRNA期初被當作轉錄噪聲而未被重視，但越來越多的研究表明LncRNA在多個腫瘤中發(fā)揮重要作用。SUN等[15]發(fā)現(xiàn)MEG3調控胃癌的增殖和凋亡，在胃癌中提示預后不良的指標。LIU等[16]發(fā)現(xiàn)lncRNA-LET在肺癌中通過抑制EMT和Wnt/β-catenin抑制肺癌的進展。在非小細胞肺癌中，SNHG1表達增高，在非小細胞肺癌中干擾SNHG1表達后細胞增殖受抑制[17]。ROR是新近發(fā)現(xiàn)的參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展多個過程的LncRNA。FAN等[18]研究發(fā)現(xiàn)ROR通過阻礙組蛋白G9A甲基轉移酶、促進組蛋白H3K9甲基化的釋放，從而激活TESC啟動子。沉默ROR后，通過G9A甲基轉移酶介導的H3K9甲基化引起的TESC啟動子的表達被抑制，進而顯著抑制腫瘤細胞增殖和轉移。進一步研究表明，在不沉默ROR的情況下，沉默TESC啟動子引起腫瘤增殖、轉移方面類似的現(xiàn)象。從而證實，ROR作為一個誘餌RNA通過抑制組蛋白修飾酶的結合促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ZHAN等[19]研究表明ROR通過調控ZEB1來促進胰腺癌的侵襲、轉移。LI等[20]ROR與鼻咽癌的增殖、轉移、凋亡、耐藥均有關。我們的前期研究已經發(fā)現(xiàn)，結直腸癌中ROR的表達明顯低于周圍正常組織，其表達與病人的TNM分期有關，但關于ROR在結直腸癌轉移中的作用尚缺乏深入的研究。

細胞的遷移實驗是模擬腫瘤轉移的理想體外模型，遷移實驗通過Transwell小室將腫瘤細胞隔離在無血清培養(yǎng)液中，腫瘤細胞為了獲取有血清的培養(yǎng)液，必須爬行穿過小室的孔隙，我們通過技術穿過孔隙的細胞數(shù)來評估細胞的遷移能力。細胞的侵襲實驗除了常規(guī)的遷移實驗外，我們在Transwell的上室中加入了Matregel膠，腫瘤細胞為了到達有血清的下室，除了穿過小室的孔隙，還需要穿過Matregel膠，結合遷移實驗，可以更加完整的模擬腫瘤體內轉移途徑。我們的研究發(fā)現(xiàn)ROR過表達的SW620細胞不論在遷移還是在侵襲實驗中，均表現(xiàn)出較低的遷移、侵襲能力。細胞劃痕是模擬細胞爬行愈合能力的一個重要實驗，通過對貼壁細胞劃痕后觀察細胞爬行愈合能力來評估細胞的轉移能力。我們在劃痕實驗中發(fā)現(xiàn)，ROR過表達的SW620細胞及對照組細胞在初始劃痕時間距無明顯差異，經過48 h的培養(yǎng)液后，SW620/ROR組細胞的間距明顯寬于對照組，說明ROR的過表達導致SW620細胞的爬行愈合能力下降。綜上所述，SW620細胞中過表達ROR導致SW620細胞的遷移、侵襲、劃痕愈合能力下降，表明ROR的過表達可導致結直腸SW620細胞轉移能力下降，ROR作為潛在的抑癌基因，其作用機制值得進一步研究。