趙 翔 孫 超 湯利文 向 潔 趙士敏 許 崗

（湖南福來格生物技術(shù)有限公司，湖南 長沙 422010）

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的活性三肽[1]，由于其重要的抗氧化生理功能，GSH 在食品、醫(yī)藥、保健品及化妝品領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用[2-3]。谷胱甘肽在生物體內(nèi)最普遍的合成途徑是通過2 步依賴于ATP 的酶催化完成，首先利用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH Ⅰ）將谷氨酸和半胱氨酸催化合成谷氨?；腚装彼幔偻ㄟ^谷胱甘肽合成酶（GSH Ⅱ）連接甘氨酸合成谷胱甘肽[4]。近年來在一些革蘭氏陽性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)一種新型的雙功能谷胱甘肽合成酶（GshF），兼具GSH Ⅰ和GSH Ⅱ的活性[5]，能將3 種氨基酸直接催化合成谷胱甘肽，且產(chǎn)物對(duì)其不存在反饋抑制，在谷胱甘肽生物合成中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌種

重組GshF 大腸桿菌和畢赤酵母菌由該實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建和保存。

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌SOC 培養(yǎng)基：2%的胰蛋白胨，0.5 %的酵母提取物，10 mM 的NaCl，2.5 mM 的KCl，10 mM 的MgCl2，10 mM的MgSO4，20 mM 的葡萄糖。

酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：4%的甘油，1.5%的硫酸鎂，0.25%的硫酸鈣，0.15%的NaCl，0.6%的KOH，10 mL/L 的磷酸，2 mL/L 的微量元素PTM1。

1.3 培養(yǎng)條件

大腸桿菌培養(yǎng)條件控制：活化種子按1%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，初始pH7.0，培養(yǎng)溫度37 ℃，調(diào)節(jié)空氣流量和轉(zhuǎn)速，控制溶氧40%以上，溶氧反彈開始補(bǔ)加葡萄糖，使用溶氧反饋補(bǔ)料方式，當(dāng)OD600達(dá)到要求時(shí)，緩慢降溫誘導(dǎo)，全程氨水調(diào)節(jié)pH 值。

酵母菌培養(yǎng)條件控制：按1%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，初始pH5.0，溫度30 ℃，調(diào)節(jié)空氣流量和轉(zhuǎn)速，控制溶氧30%以上，溶氧反彈后開始補(bǔ)加甘油，8 h 后單獨(dú)補(bǔ)加甲醇，溶氧反饋補(bǔ)加，氨水調(diào)節(jié)pH 值，發(fā)酵時(shí)間為115 h。

1.4 檢測方法

1.4.1 生物量測定

細(xì)胞密度測定：取適量發(fā)酵液于紫外可見光分光光度計(jì)上，測600 nm 處的吸光光度，以O(shè)D600值表示發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度。

菌體生物量的測定：取發(fā)酵液10 mL 吸入離心管內(nèi)，控制轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，離心20 min 后棄去上清液進(jìn)行稱重，計(jì)算后即為菌體質(zhì)量濃度。

1.4.2 粗酶液抽提

移取0.5 mL 發(fā)酵液樣品于1.5 mL 規(guī)格的離心管中（離心管中預(yù)先加入一定量的玻璃珠），在MS3 振蕩器上振蕩20 min（振蕩器振蕩頻率設(shè)為1 500 次/min），離心取清液作為粗酶液。

1.4.3 谷胱甘肽合成酶活力檢測

依次稱取半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、ATP 和MgCl2·6H2O溶解于0.1 mol/L、pH8.0 的Tris-HCl 緩沖液配制成的底物溶液，其中半胱氨酸∶谷氨酸∶甘氨酸∶ATP ∶Mg2+摩爾比為80 ∶120 ∶120 ∶120 ∶160。精確移取粗酶液至50 mL試管中，加入已預(yù)熱至37 ℃的底物溶液10 mL，于37 ℃的水浴中攪拌反應(yīng)10 min 后，加入25%的三氯乙酸溶液2 mL終止反應(yīng)。離心上清液定容后進(jìn)行HPLC 分析（色譜柱shimpack XR-ODS 2 μm 4.6 mm×30 mm，波長210 nm，流速1.0 mL/min）。谷胱甘肽合成酶活力計(jì)算公式為：

式中：W1為谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品稱量，mg。p1為谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品含量，%。A1和A2為樣品HPLC 檢測中谷胱甘肽面積。M 為谷胱甘肽分子量。T 為反應(yīng)時(shí)間，min。V 為液態(tài)酶取樣量，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌表達(dá)GshF的發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)溫度的考察

誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長速率、質(zhì)粒穩(wěn)定性和產(chǎn)物蛋白折疊等都有重要影響。為獲得最佳誘導(dǎo)溫度，分別調(diào)整誘導(dǎo)溫度至23 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃進(jìn)行優(yōu)化對(duì)比，結(jié)果如圖1 所示。在25 ℃誘導(dǎo)時(shí)，酶活達(dá)到最高值（68.5 U/mL）。在較低的溫度條件下雖然有利于其分泌和正確的折疊，但總菌體量和酶活較低。在較高溫度條件下，GshF 的過快表達(dá)可能會(huì)影響其正確折疊，容易產(chǎn)生包涵體。

圖1 誘導(dǎo)溫度對(duì)大腸桿菌表達(dá)GshF 的影響

2.1.2 誘導(dǎo)pH的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中在發(fā)酵前期控制pH7.0，誘導(dǎo)后分別控制pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0 培養(yǎng)40 h 后檢測酶活。結(jié)果如圖2 所示，最適宜的誘導(dǎo)表達(dá)pH 為6.5，GshF 發(fā)酵活力達(dá)到71.4 U/mL。

圖2 誘導(dǎo)pH 對(duì)大腸桿菌表達(dá)GshF 的影響

2.1.3 誘導(dǎo)劑的選擇

實(shí)驗(yàn)分別選用0.2 mmol/L的IPTG、1.2%的半乳糖和1.2%的乳糖進(jìn)行對(duì)比，在分批補(bǔ)料的控制下誘導(dǎo)培養(yǎng)40 h，檢測酶活，結(jié)果如圖3 所示。乳糖誘導(dǎo)活力達(dá)到71.2 U/mL，與強(qiáng)誘導(dǎo)劑IPTG 結(jié)果基本一致，優(yōu)于半乳糖的誘導(dǎo)結(jié)果。此外乳糖還具備無毒和價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，更適合在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中使用。

2.1.4 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇

分別選擇細(xì)胞密度OD600值在20、25、30、35、40、45加入1.2%的乳糖誘導(dǎo)，結(jié)果如圖4 所示。在重組菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期OD600=35 時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，GshF 的可溶表達(dá)量最大，此時(shí)酶活最高，達(dá)到75.2 U/mL。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)過早會(huì)導(dǎo)致菌體終濃度下降從而影響GshF 產(chǎn)量。而過晚誘導(dǎo)，雖可獲得較高的菌體量，但酶活表達(dá)明顯下降。

圖3 誘導(dǎo)劑種類對(duì)大腸桿菌表達(dá)GshF 的影響

圖4 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)大腸桿菌表達(dá)GshF 的影響

2.2 畢赤酵母表達(dá)GshF發(fā)酵工藝優(yōu)化

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能在唯一碳源甲醇的誘導(dǎo)下高效啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)，畢赤酵母的培養(yǎng)通常分為菌體生產(chǎn)和甲醇誘導(dǎo)2 個(gè)階段，通過生長環(huán)境和補(bǔ)料策略的控制，可以達(dá)到提高外源蛋白表達(dá)量的目的[6]。

2.2.1 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

由圖5 可知，畢赤酵母酶活表達(dá)呈現(xiàn)前期增速慢，中期酶活增長快，后期酶活略有降低的趨勢(shì)。誘導(dǎo)溫度25 ℃條件下，GshF 酶活最高，達(dá)到110.3 U/mL，因此選擇誘導(dǎo)溫度為25 ℃。

2.2.2 誘導(dǎo)pH優(yōu)化

誘導(dǎo)pH 優(yōu)化結(jié)果如圖6 所示，pH5.0 和pH5.5 酶活較高，增長趨勢(shì)也比較一致，GshF 最高酶活分別為124.1 U/mL和120.6 U/mL。根據(jù)分析結(jié)果，選擇畢赤酵母的誘導(dǎo)pH 為5.0。

2.2.3 溶氧控制范圍的優(yōu)化

畢赤酵母利用甲醇時(shí)需要消耗大量的氧氣，溶氧不足會(huì)限制菌體增殖，并且造成甲醇及其代謝物的累積。圖7 表明：當(dāng)溶氧控制在10%以下，中后期酶活增長平緩。當(dāng)溶氧控制超過40%，酶活也較低。所以過高或過低的溶氧都不利于畢赤酵母合成GshF，當(dāng)溶氧范圍為10%～20%時(shí)，酶活最高達(dá)到了133.5 U/mL。

圖5 誘導(dǎo)溫度對(duì)畢赤酵母表達(dá)GshF 的影響

圖6 誘導(dǎo)pH 對(duì)畢赤酵母表達(dá)GshF 的影響

圖7 溶氧控制范圍對(duì)畢赤酵母表達(dá)GshF 的影響

3 結(jié)論

利用發(fā)酵罐研究了重組大腸桿菌誘導(dǎo)溫度、pH 值、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)等培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長及GshF 酶活的影響，確定最佳培養(yǎng)條件為pH6.5、誘導(dǎo)溫度25 ℃、在對(duì)數(shù)生長中期（OD600=35）時(shí)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，GshF 酶活達(dá)到75.2 U/mL，比優(yōu)化前提高了31.3%。同時(shí)還對(duì)表達(dá)GshF 畢赤酵母菌的發(fā)酵工藝進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，確定誘導(dǎo)條件為25 ℃、pH5.0和溶氧控制范圍為10%～20%，GshF 最高酶活為133.5 U/mL。經(jīng)過優(yōu)化后的大腸桿菌和畢赤酵母的發(fā)酵、GshF 酶活都能達(dá)到較高水平，可以依據(jù)用途選擇不同的宿主菌進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。