謝歡 譚茹月 鄧晶晶

[摘要] 目的 建立采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行大鼠血漿中柴胡注射液有效成分柴胡皂苷d濃度測(cè)定的方法。方法 取SD雄性大鼠6只，腹腔注射柴胡注射液5 mL/kg，并在不同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈取血，以乙酸乙酯沉淀蛋白法處理血樣，并采用HPLC法測(cè)定柴胡皂苷d的血藥濃度。色譜柱為SWELL Chromplus C18（250 mm × 4 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（梯度洗脫），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm，柱溫：30℃，流速1 mL/min。 結(jié)果 大鼠血漿中柴胡皂苷d的線性范圍為0.1～2 mg/mL（r = 0.9955）;低、中、高3個(gè)濃度準(zhǔn)確度回收率分別為92.95%、105.52%、97.86%，日內(nèi)及日間精密度RSD值均<6%，檢測(cè)限為2 μg/mL。低、中、高3個(gè)濃度血漿樣品在室溫放置12 h、-20℃冰箱冷凍保存10 d，反復(fù)凍融3次等情況下的穩(wěn)定性均較好。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，適用于柴胡皂苷d血藥濃度的測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 柴胡注射液;柴胡皂苷d;高效液相色譜法;血藥濃度

[中圖分類號(hào)] R969.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）05（c）-0123-04

Determination of blood concentration of active component in Bupleurum Injection

XIE Huan? ?TAN Ruyue? ?DENG Jingjing

School of Pharmacy， Chengdu Medical College， Sichuan Province， Chengdu? ?610500， China

[Abstract] Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） for the determination of saikosaponin d of Bupleurum Injection in rat plasma. Methods Six SD male rats were intraperitoneally injected with Bupleurum Injection of 5 mL/kg， and the blood was collected from the tail vein at different time points. The blood samples were treated with ethyl acetate precipitated protein method， and the blood concentration of saikosaponin d was determined by HPLC. The column Swell chromplus-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used as the column. The mobile phase was water-acetonitrile （gradient elute）， the detection wavelength was 204 nm， the column temperature was 30℃ and with the flow rate of 1.0 mL/min. Results The linear range of saikosaponin d in rat plasma was 0.1-2 mg/mL （r = 0.9955）. The accuracy recovery rates of low， medium and high concentrations were 92.95%， 105.52% and 97.86%， respectively. The RSD values of intra-day and intra-day precision were all < 6%， and the detection limit was 2 μg/mL. Plasma samples with low， medium and high concentrations were kept stable for 12 h at room temperature， frozen at -20℃ for 10 d， and repeatedly frozen and thawed 3 times. Conclusion The method is accurate， specific， and suitable for the determination of saikosaponin d of Bupleurum Injection in rat plasma.

[Key words] Bupleurum Injection; Saikosaponin d; High performance liquid chromatography; Plasma concentration

柴胡注射液是傘形科植物北柴胡的干燥根經(jīng)水蒸氣蒸餾制成的水溶液[1-2]，常用于治療流行性感冒、瘧疾等疾病引起的發(fā)熱[3]。隨著柴胡注射液在臨床上的應(yīng)用日益增加，其注射后產(chǎn)生的神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)、肝腎損傷、過敏性休克等不良反應(yīng)的報(bào)道也隨之增加[4-9]，因此，對(duì)該藥物質(zhì)量控制方面的深入研究顯得尤為重要。

目前對(duì)柴胡注射液的研究多為體外主要成分測(cè)定[10-13]及解熱機(jī)制[14-15]等方面的內(nèi)容，對(duì)其體內(nèi)的血藥濃度測(cè)定鮮見報(bào)道。本研究以柴胡皂苷d為檢測(cè)指標(biāo)，測(cè)定其血藥濃度，探討柴胡注射液中柴胡皂苷d在大鼠體內(nèi)變化過程。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）;CPA225D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;JPN200氮吹儀（上海繼譜電子科技有限公司）。

1.2 試藥

柴胡注射液（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：2 mL/支，批號(hào)：17052611、17110908、17120812）;0.9%的氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：L21909 0110）;肝素（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2017 0426）;柴胡皂苷d對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-17050106，純度：≥98%）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重（200±20）g，6周齡，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[合格證號(hào)：SCXK（川）2018-0024]。大鼠飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度20～26℃，相對(duì)濕度為40%～60%。在給藥前12 h開始禁食，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SWELL Chromplus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)：204 nm;進(jìn)樣量：20 μL;流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min：5%～13%A;5～20 min：13%～16%A;20～25 min：16%～25%A;25～35 min：25%～40%A;35～40 min：40%～55%A;40～50 min：55%～65%A）。

2.2 柴胡皂苷d對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱取柴胡皂苷d對(duì)照品40 mg，用甲醇溶解，并定容至10 mL容量瓶中，制成4 mg/mL的柴胡皂苷d對(duì)照品貯備液，保存于-4℃冰箱中，備用。

2.3 給藥方法及樣品采集

SD雄性大鼠6只，體重（200±20）g，給藥前12 h禁食，不禁水，腹腔注射柴胡注射液5 mL/kg，尾靜脈取血0.5 mL放于肝素浸潤(rùn)過的EP管內(nèi)，4000 r/min離心5 min，取血漿0.2 mL轉(zhuǎn)移至另一EP管中，于-20℃冰箱保存，待測(cè)。

2.4 血漿樣品的處理

在0.2 mL血漿樣品中加入0.8 mL乙酸乙酯去蛋白，渦旋3 min，5000 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，40℃氮?dú)獯蹈?，加入乙?.2 mL復(fù)溶，渦旋3 min，進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析，進(jìn)樣前用0.22 μm的微孔濾膜濾過。

2.5 方法學(xué)的驗(yàn)證

2.5.1專屬性? 取空白血漿樣品0.5 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，并按“2.1”項(xiàng)下HPLC色譜條件測(cè)定;取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋至濃度為0.2 mg/mL的柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，柴胡皂苷d的保留時(shí)間為42.621 min;將0.2 mg/mL的柴胡皂苷d加入到0.1 mL空白血漿中，同法測(cè)定，柴胡皂苷d的保留時(shí)間為42.787 min;取大鼠給藥后采集的血漿樣品0.2 mL，依法操作，所得含藥血漿樣品柴胡皂苷d保留時(shí)間為42.478 min，對(duì)照品與含藥血漿樣品的色譜圖中，柴胡皂苷d的色譜峰保留時(shí)間一致，同時(shí)血漿中的雜質(zhì)不影響其測(cè)定。柴胡皂苷d的保留時(shí)間在42.5 min左右，其峰形良好，雜質(zhì)峰影響較小。見圖1。

2.5.2 線性范圍? 精密吸取100 μL的大鼠空白血漿6份，分別依次加入“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按照“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，制得一系列濃度的含藥血漿。隨后按照“2.1”項(xiàng)下的條件測(cè)定。以血漿中柴胡皂苷d的濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 1784.3 X+35.47（r = 0.9955），標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，在0.1～2 mg/mL的濃度范圍內(nèi)兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r = 0.9955（n = 6），定量下限為0.1 mg/mL。

2.5.3 準(zhǔn)確度與精密度的測(cè)定? 取大鼠空白血漿100 μL，加對(duì)照品儲(chǔ)備液分別配置低、中、高3個(gè)濃度（分別為0.2、0.8、2.0 mg/mL）的柴胡皂苷d的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品溶液，每個(gè)濃度5份樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出柴胡皂苷d的濃度，并考察方法的準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度及日間精密度，見表2。結(jié)果顯示該方法的準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度及日間精密度均符合方法學(xué)驗(yàn)證要求。

2.5.4 提取回收率測(cè)定與檢測(cè)限的測(cè)定? 取大鼠空白血漿100 μL，加入對(duì)照品儲(chǔ)備液分別配制成“2.5.3”項(xiàng)下低、中、高3種濃度的血漿樣品，每個(gè)濃度5份樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積為A。另取空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，分別加入低、中、高3種濃度的柴胡皂苷d對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積為B。按A/B×100%計(jì)算柴胡皂苷d低、中、高3種濃度的提取回收率分別為75.64%、82.31%、88.97%，各濃度水平的RSD≤6.43%（n = 5）。以1 mg/mL柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)溶液為基礎(chǔ)無限稀釋數(shù)倍，同法測(cè)定記錄峰面積，以信噪比等于3時(shí)對(duì)應(yīng)的血漿中的柴胡皂苷d的濃度為本方法的檢測(cè)限，結(jié)果顯示，大鼠血漿中柴胡皂苷d經(jīng)本法測(cè)定的的檢測(cè)限為2 μg/mL。

2.5.5 穩(wěn)定性考察? 取大鼠空白血漿100 μL，加對(duì)照品儲(chǔ)備液分別配置成如上低、中、高3個(gè)濃度的柴胡皂苷d的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品溶液，每個(gè)濃度5份樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。分別考察含藥血漿在室溫放置8 h（0、2、4、6、8 h）、-20℃冰箱冷凍保存10 d，反復(fù)凍融3次等情況下對(duì)穩(wěn)定性的影響，見表3，結(jié)果顯示該方法在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.6 血漿樣品中柴胡皂苷d含量的測(cè)定

取大鼠血漿樣品按“2.4”項(xiàng)下方法處理后再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算血藥濃度，30 min時(shí)的血藥濃度為0.637 mg/mL，45 min時(shí)的血藥濃度為0.852 mg/mL，75 min時(shí)的血藥濃度為1.884 mg/mL，120 min時(shí)的血藥濃度為0.680 mg/mL，150 min時(shí)的血藥濃度為0.549 mg/mL。

3 討論

確定給藥劑量時(shí)，按照人與大鼠間體表面積折算的等效劑量比值所得，普通成人體內(nèi)注射劑量為4 mL，推算大鼠注射劑量應(yīng)為0.024 mL，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此劑量在腹腔注射時(shí)濃度過低，且取樣量太小不易于操作，故查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1，10]后并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，腹腔注射的用藥劑量為5 mL/kg。

在血漿樣品前處理時(shí)，本研究嘗試了采用乙腈和乙酸乙酯分別沉淀蛋白，結(jié)果顯示，乙腈沉淀蛋白后的血漿樣品有較多的白色不溶性雜質(zhì)，且色譜圖上雜質(zhì)峰較多;采用等量乙酸乙酯沉淀蛋白后幾乎未見雜質(zhì)的沉積，且色譜圖上雜質(zhì)峰也相對(duì)較少，故本研究最終采用乙酸乙酯沉淀蛋白。

在HPLC確定檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)[16-20]，204、208 nm和210 nm都可作為柴胡皂苷d的測(cè)定波長(zhǎng)。本研究在對(duì)柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外掃描時(shí)，結(jié)果顯示204、208、210、278 nm處均有吸收，其中204 nm處吸光度最大，且無其他色譜峰干擾。以278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，血漿樣品測(cè)定結(jié)果顯示無明顯吸收;以208、210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，血漿樣品溶液和體外標(biāo)準(zhǔn)品溶液的測(cè)定圖譜顯示柴胡皂苷d吸收峰均不及204 nm時(shí)測(cè)定的高，故最終選擇204 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究采用HPLC法建立了在大鼠血漿樣品中柴胡注射液的柴胡皂苷d含量的測(cè)定方法，結(jié)果顯示該法回收率高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，后續(xù)可用于柴胡注射液中柴胡皂苷d的藥動(dòng)學(xué)研究。

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（收稿日期：2019-10-11? 本文編輯：劉永巧）