王瑞旋, 李 炳, 林華劍, 陳 琦, 陳秀程, 5, 牟紅莉, 王江勇

牡蠣體內(nèi)及其養(yǎng)殖水體中細(xì)菌耐藥性研究

王瑞旋1, 李 炳2, 林華劍3, 陳 琦4, 陳秀程2, 5, 牟紅莉2, 王江勇2

(1. 韓山師范學(xué)院, 廣東 潮州 521041; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所, 廣東 廣州 510300; 3. 廣東省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 廣東 廣州 511400; 4. 華南師范大學(xué), 廣東 廣州 510631; 5. 天津農(nóng)學(xué)院, 天津 300384)

為進(jìn)一步了解牡蠣體內(nèi)外細(xì)菌的耐藥性, 對(duì)分離自陽(yáng)江的香港牡蠣()養(yǎng)殖水體及其內(nèi)臟團(tuán)的637個(gè)異養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了10種抗生素的藥敏試驗(yàn)。采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer, 簡(jiǎn)稱K-B), 參照NCCLS抗生素敏感試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn), 研究細(xì)菌的耐藥概況。結(jié)果顯示: 健康牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)恩諾沙星和慶大霉素耐藥率較低, 發(fā)病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)慶大霉素耐藥率最低, 次之為復(fù)合磺胺和恩諾沙星; 水體細(xì)菌對(duì)氯霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星耐藥率較低, 水體及體內(nèi)細(xì)菌對(duì)呋喃唑酮耐藥率最高, 而對(duì)卡那霉素及青霉素耐藥率則波動(dòng)較大。結(jié)果還顯示, 不同來(lái)源的受試菌株多重耐藥狀況嚴(yán)重, 來(lái)源于健康和病牡蠣的菌株在7月份的多重耐藥率達(dá)到峰值, 分別為66.7%和64.3%, 養(yǎng)殖水體細(xì)菌多重耐藥率峰值出現(xiàn)在4月份, 最高達(dá)76.7%?？傮w來(lái)看, 源于牡蠣養(yǎng)殖環(huán)境水體及其牡蠣體內(nèi)的異養(yǎng)菌多重耐藥比例較高, 值得引起注意。而受試菌株對(duì)不同藥物的抗性存在較大差異, 且異養(yǎng)細(xì)菌對(duì)呋喃唑酮的耐藥率明顯高于對(duì)其它受測(cè)抗生素的耐藥率。從時(shí)間動(dòng)態(tài)上看, 水體菌耐藥率峰值出現(xiàn)于4月份, 而牡蠣體內(nèi)菌群耐藥率峰值出現(xiàn)于7月份。

香港牡蠣(); 異養(yǎng)菌; 弧菌; 抗生素; 耐藥性

牡蠣, 俗稱海蠣子、蠔等, 是我國(guó)著名的四大養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一。牡蠣屬濾食性動(dòng)物, 通過(guò)不斷過(guò)濾海水來(lái)獲取其中的微生物作為食物。在濾食過(guò)程中, 隨著時(shí)間的變化可積聚環(huán)境水體中的細(xì)菌, 其中包括致病菌[1]。香港牡蠣()是我國(guó)南方重要海水養(yǎng)殖貝類, 主要分布于浙江、江蘇、福建、廣東和廣西等沿海低潮區(qū)[2-3]。正常養(yǎng)殖情況下, 其產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)效益良好。然而, 自1992年以來(lái)頻發(fā)的大規(guī)模死亡事件嚴(yán)重影響了牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。細(xì)菌性疾病在貝類養(yǎng)殖病害事件中常扮演重要角色, 尤其在高溫季節(jié), 牡蠣大批量異常死亡現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生, 其中以條件致病性著稱的弧菌()出現(xiàn)頻率最高。在海洋環(huán)境中, 弧菌幾乎無(wú)處不在, 包括海水、底泥等, 甚至健康牡蠣的體內(nèi)都可能存在弧菌。在養(yǎng)殖過(guò)程中, 當(dāng)牡蠣抵抗力低下且環(huán)境中致病性弧菌達(dá)到一定閾值時(shí), 即可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生, 從而引起大量死亡。尤其是剛固著的稚貝更易受到感染, 病原菌往往借助水流及牡蠣自身的濾食性, 在貝體內(nèi)積累, 當(dāng)條件適合時(shí), 即可能侵襲貝體韌帶、外套膜和鰓, 最后全身感染而死[5]。至今, 與細(xì)菌性疾病直接相關(guān)的防治手段仍以抗生素為主, 抗生素已被廣泛應(yīng)用于控制人類、畜禽和水生動(dòng)物的細(xì)菌性疾病。由于水環(huán)境的復(fù)雜性和流動(dòng)性, 抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用很可能對(duì)環(huán)境產(chǎn)生更為嚴(yán)重的不良影響。甚至在盲目使用抗生素后, 取得的效果常常與養(yǎng)殖戶的預(yù)期相悖。在抗生素的選擇壓力下, 耐藥菌保留下來(lái)并大量繁殖[6-7]。已有報(bào)道對(duì)雜色鮑體內(nèi)及其養(yǎng)殖水體中異養(yǎng)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株對(duì)四環(huán)素、青霉素G、卡那霉素、丁胺卡那霉素等產(chǎn)生了抗藥性[8]。葉茂華等[9]對(duì)貝類中弧菌耐藥性研究發(fā)現(xiàn), 受試的28株菌中有25株對(duì)氨芐西林耐藥, 1株對(duì)四環(huán)素耐藥; 鄧歡等[10]對(duì)從太平洋牡蠣發(fā)病幼體中分離的三種弧菌進(jìn)行耐藥性鑒定, 顯示3株菌均對(duì)氯霉素、紅霉素敏感, 對(duì)呋喃唑酮、青霉素耐藥; 張占會(huì)等[11]對(duì)4株香港牡蠣致病菌進(jìn)行藥敏測(cè)定, 結(jié)果顯示菌株均對(duì)青霉素類藥品具有抗性。而筆者在以往對(duì)鮑體內(nèi)弧菌的耐藥性研究中發(fā)現(xiàn), 弧菌對(duì)多種藥物的耐藥率與環(huán)境因子顯著相關(guān)并呈現(xiàn)一定的季節(jié)規(guī)律性[12]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于貝類養(yǎng)殖水體及貝體內(nèi)細(xì)菌的耐藥性研究極少, 而牡蠣作為重要的濾食性貝類, 與養(yǎng)殖環(huán)境關(guān)系密切, 且牡蠣屬于河口養(yǎng)殖種類, 更接近人類居住環(huán)境及陸地養(yǎng)殖系統(tǒng), 因此, 對(duì)牡蠣養(yǎng)殖環(huán)境及其體內(nèi)細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行了解和分析具有重要的意義。

本研究對(duì)采自陽(yáng)江的香港牡蠣養(yǎng)殖水體和牡蠣體內(nèi)的637株異養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了藥物敏感性測(cè)試, 并對(duì)健康牡蠣和發(fā)病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌的耐藥率進(jìn)行了比較, 深入了解牡蠣體內(nèi)外環(huán)境異養(yǎng)菌的耐藥狀況, 以期為貝類細(xì)菌性疾病預(yù)警防控及河口環(huán)境評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2018年1月—12月份定期至陽(yáng)江的牡蠣主養(yǎng)區(qū)(東經(jīng): 111°73′, 北緯: 21°79′), 隨機(jī)分離獲得637個(gè)菌株, 其中牡蠣養(yǎng)殖水體細(xì)菌287株(2216E 培養(yǎng)基, 劃線法), 健康牡蠣和病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌共350株(營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基, 劃線法)。健康牡蠣和病牡蠣體內(nèi)菌株來(lái)源如下: 在疾病暴發(fā)階段, 從正常養(yǎng)殖區(qū)(未發(fā)現(xiàn)異常死亡現(xiàn)象)和疫區(qū)(出現(xiàn)大量異常死亡現(xiàn)象)進(jìn)行采樣。優(yōu)選正常養(yǎng)殖區(qū)采集健康牡蠣, 從鄰近海域疫區(qū)采集病牡蠣。初步判別方法: 敲擊牡蠣貝殼, 健康牡蠣會(huì)迅速閉上貝殼; 反之, 如反應(yīng)遲鈍、閉殼肌無(wú)力則為活力差的病牡蠣, 且在進(jìn)一步的解剖過(guò)程中可見(jiàn)病牡蠣貝體較消瘦, 閉殼肌無(wú)力, 部分出現(xiàn)顏色異常情況。

具體采樣情況如表1所示。

1.2 抗生素的選擇

表1 2018年不同月份采集分離出的牡蠣體內(nèi)菌及水體菌優(yōu)勢(shì)菌株數(shù)(株)

表2　標(biāo)準(zhǔn)菌株紙片擴(kuò)散法測(cè)定非苛養(yǎng)細(xì)菌抗生素藥物敏感性

1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基、Mueller-Hinton瓊脂(MHA)培養(yǎng)基, 均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技公司。

1.4 方法

1.4.1 受試菌株的濃度確定及初步鑒定

菌株濃度確定: 為確定藥敏試驗(yàn)時(shí)菌液稀釋倍數(shù), 選取生長(zhǎng)狀況良好且具有一定代表性的菌株(編號(hào)貝11和貝12), 以無(wú)菌生理鹽水洗脫于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)了24 h(28℃)的菌苔, 分別稀釋至10–6、10–7, 通過(guò)平板涂布法對(duì)受試菌株進(jìn)行了濃度分析[3]。

菌株初步鑒定: 煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA, 作為模板, 將純培養(yǎng)菌液煮沸(或100℃水浴)10 min 后立即冷卻, 12 000 r/min離心10 min, 取上清為模板, 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增并分析保守區(qū)16S rDNA 序列, 對(duì)所有受試菌株進(jìn)行初步鑒定(到屬水平), 涉及16S rDNA通用引物序列及反應(yīng)體系、反應(yīng)條件如下[3]:

引物: 8 f: 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′, 1492r: 5′GGTTACCTTGTTACGACTT 3′; 反應(yīng)體系(50 μL): 水: 36.5 μL, dNTPs: 4 μL, 10×緩沖液5 μL, Taq 酶 0.5 μL, 引物8f 1 μL, 引物1492r 1 μL, 模板DNA 2 μL.

反應(yīng)條件: 95℃5 min, 95℃1 min, 48℃1 min, 72℃2 min 30個(gè)循環(huán), 72℃10 min, 4℃保存。

1.4.2 藥敏試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法(簡(jiǎn)稱K-B 法), 針對(duì)10種常見(jiàn)抗生素進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗(yàn), 參照NCCLS抗生素敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)研究文獻(xiàn)進(jìn)行操作[7, 14-17]。

1.4.3 抑菌圈的測(cè)量

使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑, 抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)如表3所示, 根據(jù)表3將藥敏測(cè)試結(jié)果分別判定為R(耐藥)、I(中度敏感)、S(敏感), 分別統(tǒng)計(jì)各月份牡蠣養(yǎng)殖水體細(xì)菌、健康牡蠣體內(nèi)細(xì)菌和病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)各種抗生素的耐藥率、敏感率和多重耐藥率(耐受3種或3種以上藥物)的菌株百分比。

2 結(jié)果

2.1 菌株濃度測(cè)試結(jié)果及受試菌株分屬種類概況

根據(jù)稀釋濃度要求, 用于菌懸液的濃度約為108CFU/mL, 平板涂布結(jié)果顯示受試的兩個(gè)菌株濃度約為1.30×108CFU/mL和2.80×109CFU/mL, 表明數(shù)量級(jí)在108~109CFU/mL, 符合藥敏測(cè)試要求[14]。

表3　藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)

注: S: 敏感, I: 中度敏感, R: 耐藥

同時(shí), 經(jīng)引物擴(kuò)增后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析, 結(jié)果顯示80%受試異養(yǎng)菌為弧菌科, 主要為弧菌屬, 其次為希瓦氏菌, 其余菌屬如黃單胞菌、芽孢桿菌、假單胞菌等菌群為隨機(jī)出現(xiàn), 每月所占比例低于5%。

2.2 健康牡蠣體內(nèi)及其養(yǎng)殖水體細(xì)菌對(duì)不同抗生素的藥敏測(cè)試結(jié)果

健康牡蠣體內(nèi)及養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌對(duì) 10 種抗生素藥敏測(cè)試結(jié)果如表4所示, 健康牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)恩諾沙星的敏感率高達(dá)83.7%, 對(duì)慶大霉素敏感率為83.0%, 依次對(duì)復(fù)合磺胺、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氯霉素敏感率在70%以上, 而對(duì)卡那霉素、利福平、青霉素G、呋喃唑酮敏感率在60%以下。牡蠣養(yǎng)殖水體菌敏感率最高的藥物是氯霉素(達(dá)92.3%), 對(duì)恩諾沙星敏感率是86.1%, 對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)合磺胺、慶大霉素的敏感率分別為83.6%、79.8%、71.4%, 對(duì)四環(huán)素、青霉素G、卡那霉素、利福平、呋喃唑酮敏感率在70.0%以下?？傮w看, 牡蠣體內(nèi)菌及水體菌對(duì)恩諾沙星耐藥率最低, 分別為1.4%和0.7%。

2.3 病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)10種抗生素的藥敏測(cè)試結(jié)果

病牡蠣對(duì)10種抗生素的藥敏測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表5, 受試菌株對(duì)慶大霉素最敏感(敏感率最高達(dá)92.6%),其次對(duì)復(fù)合磺胺和恩諾沙星敏感率分別為88.2%、85.3%,而對(duì)四環(huán)素、卡那霉素、青霉素G、利福平等藥物的敏感率低于75.0%; 病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)利福平、青霉素G耐藥率則較高, 均高于40.0%。

表4 健康牡蠣體內(nèi)及其養(yǎng)殖水體細(xì)菌對(duì)不同抗生素的敏感度(%)

注: S: 敏感, I: 中度敏感, R: 耐藥

表5 病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)不同抗生素的敏感度(%)

注: S: 敏感, I: 中度敏感, R: 耐藥

2.4 不同月份健康牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)10種抗生素的耐藥率

從對(duì)10種抗生素的耐藥率總體來(lái)看, 4月、6—10月、12月健康牡蠣體內(nèi)細(xì)菌耐藥比例較高(圖1)。其中, 部分異養(yǎng)菌在10月份對(duì)恩諾沙星耐藥率為13.8%, 其余月份受試菌株對(duì)恩諾沙星耐藥率幾乎為0; 而對(duì)利福平、呋喃唑酮和青霉素G耐藥率明顯較高, 其中異養(yǎng)菌對(duì)青霉素G最高耐藥率為73.3%; 卡那霉素、復(fù)合磺胺、四環(huán)素的耐藥率在不同月份變化大。

圖1 健康牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)菌對(duì)10種抗生素的耐藥率

注: CIP: 環(huán)丙沙星; ENX: 恩諾沙星; GM: 慶大霉素; KNA: 卡那霉素; TMP/SMZ: 復(fù)合磺胺; F: 呋喃唑酮; RA: 利福平; P: 青霉素; TE: 四環(huán)素; C: 氯霉素.

2.5 病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)10種抗生素的耐藥率

本次監(jiān)測(cè)研究中, 于出現(xiàn)異常死亡現(xiàn)象的時(shí)期(分別是1月、4月和7月)采集到病牡蠣(圖2), 受試牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)菌對(duì)恩諾沙星耐藥性為0, 對(duì)四環(huán)素、氯霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星耐藥率較低。值得注意的是, 此3個(gè)月份的病貝體內(nèi)細(xì)菌對(duì)呋喃唑酮的耐藥率均較高(>50%), 對(duì)利福平和青霉素G的耐藥率次之。本結(jié)果提示氯霉素、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮雖已列為禁用藥物, 但動(dòng)物體內(nèi)仍存在耐藥菌, 其原因有待進(jìn)一步研究確定。此外, 結(jié)果表明細(xì)菌耐藥率于7月份達(dá)到峰值。圖2與圖1相比較顯示, 健康牡蠣和病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌耐藥總體趨勢(shì)相似, 耐藥情況呈現(xiàn)逐漸加重趨勢(shì)。

圖2 病牡蠣的體內(nèi)異養(yǎng)菌對(duì)10種抗生素的耐藥率

2.6 不同月份牡蠣養(yǎng)殖水體細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥率

對(duì)于牡蠣養(yǎng)殖水體細(xì)菌(圖3), 其對(duì)恩諾沙星的耐藥率幾乎為零; 而對(duì)呋喃唑酮、利福平、耐藥率總體上較高; 對(duì)慶大霉素、復(fù)合磺胺、環(huán)丙沙星、四環(huán)素的耐藥率變化較大, 不同月份之間差異較明顯。對(duì)比體內(nèi)外異養(yǎng)菌耐藥程度差異來(lái)看, 牡蠣養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌總體耐藥狀況比體內(nèi)細(xì)菌的嚴(yán)重, 4月份達(dá)到最高峰, 而體內(nèi)菌耐藥高峰出現(xiàn)在7月份。

圖3 牡蠣養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌對(duì)10種抗生素的耐藥率

2.7 不同月份牡蠣體內(nèi)及其養(yǎng)殖水體細(xì)菌的多重耐藥菌株比率

統(tǒng)計(jì)各月及全年陽(yáng)江牡蠣體內(nèi)及其養(yǎng)殖水體細(xì)菌多重耐藥菌株比率(表6)?？傮w顯示, 無(wú)論是健康牡蠣體內(nèi)細(xì)菌、發(fā)病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌還是養(yǎng)殖水體細(xì)菌, 三者的多重耐藥情況均較嚴(yán)重, 都在30%以上。其中發(fā)病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌多重耐藥比率最高, 為38.2%。發(fā)病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌從1月、4月、7月多重耐藥菌株比例迅速上升, 7月達(dá)到64.7%; 健康牡蠣體內(nèi)細(xì)菌多重耐藥菌株比例也在7月份最高(66.7%); 牡蠣養(yǎng)殖水體細(xì)菌多重耐藥菌株比例基本都在20%以上, 其中4月份比率最高, 達(dá)到76.7%?？傮w來(lái)看, 健康牡蠣、發(fā)病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌以及養(yǎng)殖水體細(xì)菌的多重耐藥狀況均不容忽視。綜上所述, 受試菌株對(duì)10種抗生素中恩諾沙星的耐藥率最低, 慶大霉素耐藥率相對(duì)較低, 而對(duì)呋喃唑酮耐藥率最高, 其次為利福平、青霉素、卡那霉素。而本次受試菌株顯示較嚴(yán)重的多重耐藥狀況, 尤其牡蠣體內(nèi)細(xì)菌, 且多重耐藥率于7月份達(dá)到了最高峰。

表6 牡蠣養(yǎng)殖水體及體內(nèi)細(xì)菌多重耐藥率(%)

3 分析與討論

3.1 牡蠣養(yǎng)殖水體中及其體內(nèi)細(xì)菌對(duì)不同抗生素的耐藥差異

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展, 大量的抗生素和代謝物可能被釋放到環(huán)境中, 這一現(xiàn)象被認(rèn)為是病原菌進(jìn)化和選擇性耐藥最重要的因素[15]。而細(xì)菌耐藥性可通過(guò)遺傳因子水平傳播, 這種傳播可使菌群獲得耐藥性, 從而導(dǎo)致環(huán)境中細(xì)菌耐藥狀況越加嚴(yán)重[18]。本研究對(duì)牡蠣養(yǎng)殖水體及其體內(nèi)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行了分析, 受試菌株對(duì)10種常見(jiàn)抗生素的藥敏測(cè)試結(jié)果顯示, 牡蠣養(yǎng)殖水體中異養(yǎng)菌對(duì)氯霉素耐藥率最低, 其次是喹諾酮類如恩諾沙星、環(huán)丙沙星, 其中, 氯霉素和環(huán)丙沙星作為禁用藥至今已有一段時(shí)間, 提示相關(guān)耐藥菌群正在逐漸消失, 可見(jiàn)禁用氯霉素和環(huán)丙沙星對(duì)于環(huán)境菌群的耐藥性消除起到一定的積極作用, 而水體菌株對(duì)呋喃唑酮的耐藥率則明顯高于其他9種抗生素, 其原因待進(jìn)一步查明。本次結(jié)果表明, 發(fā)病牡蠣及健康牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)菌對(duì)慶大霉素和恩諾沙星的耐藥率均較低, 而受試的水體菌株及牡蠣體內(nèi)菌株對(duì)青霉素和利福平的耐藥率在不同月份均變化較大。值得關(guān)注的是, 在時(shí)間動(dòng)態(tài)上看, 牡蠣體內(nèi)細(xì)菌耐藥高峰期出現(xiàn)于7月份, 而養(yǎng)殖水體菌的耐藥高峰期出現(xiàn)于4月份, 與以往的調(diào)查研究結(jié)果[17]一致, 4月份水體菌多重耐藥率也高于牡蠣體內(nèi)菌, 且養(yǎng)殖水體菌總體比腸道菌耐藥率高, 同時(shí)養(yǎng)殖水體菌耐藥率與牡蠣體內(nèi)細(xì)菌耐藥率相比, 峰值時(shí)間提前了3個(gè)月。該現(xiàn)象提示, 環(huán)境水體中微生物通過(guò)牡蠣的濾食性與牡蠣體內(nèi)微生物群不斷交換, 部分菌群如弧菌等逐漸在牡蠣體內(nèi)積累, 這個(gè)積累過(guò)程需要一定的時(shí)間(大約為3個(gè)月), 從而使得牡蠣體內(nèi)菌群耐藥率峰值出現(xiàn)于7月份。因此, 從耐藥菌株比例角度來(lái)看, 養(yǎng)殖環(huán)境水體中菌群直接影響牡蠣體內(nèi)菌群, 可見(jiàn)養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量的重要性。Starliper等[19]研究則表明了家畜養(yǎng)殖場(chǎng)或城市污水很可能是養(yǎng)殖水體或魚(yú)體內(nèi)耐藥菌株的重要來(lái)源, 牡蠣養(yǎng)殖區(qū)多數(shù)臨近人類居住地, 而對(duì)牡蠣養(yǎng)殖區(qū)水體及貝體內(nèi)微生物的監(jiān)測(cè)有助于了解人類活動(dòng)對(duì)沿海區(qū)域環(huán)境生物的影響。

3.2 牡蠣體內(nèi)及其養(yǎng)殖水體中細(xì)菌多重耐藥狀況

本研究發(fā)現(xiàn)健康牡蠣體內(nèi)、發(fā)病牡蠣體內(nèi)及養(yǎng)殖水體中的異養(yǎng)菌多重耐藥菌株比率均約占總量的34%。健康牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)菌多重耐藥峰值出現(xiàn)于7月份, 達(dá)60.0%以上, 病牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)菌多重耐藥率與健康牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)菌接近; 而養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌多重耐藥率峰值出現(xiàn)在4月份, 最高達(dá)76.7%?？梢?jiàn)牡蠣養(yǎng)殖區(qū)菌群的多重耐藥狀況嚴(yán)重, 已不容忽視。由于雙殼貝類的特殊生活方式, 使其與環(huán)境的關(guān)系更為密切, 抗生素的不科學(xué)使用以及攜帶殘留抗生素的養(yǎng)殖污水、城市污水的不合理排放對(duì)養(yǎng)殖區(qū)包括養(yǎng)殖貝類都會(huì)產(chǎn)生重大影響。其中施用抗生素是引起水生細(xì)菌產(chǎn)生抗性的主要原因[20-21], 由于抗生素在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中被長(zhǎng)期低劑量使用, 會(huì)誘導(dǎo)部分水生細(xì)菌對(duì)相應(yīng)藥物產(chǎn)生耐藥性甚至進(jìn)一步產(chǎn)生多重耐藥性, 而耐藥菌一旦出現(xiàn), 很可能在特定條件下通過(guò)耐藥基因或耐藥質(zhì)粒傳播耐藥性[22-24], 甚至包括部分人魚(yú)共患病原菌, 將可能極大威脅人類健康[25]。因此, 在養(yǎng)殖過(guò)程不得不使用抗生素時(shí), 應(yīng)避免以下錯(cuò)誤行為: (1)長(zhǎng)期反復(fù)使用同一種藥物。不同菌種甚至同類菌群的不同株系對(duì)相同藥物的敏感性存在差異, 如長(zhǎng)期使用同種藥物, 在藥物選擇壓力下, 耐藥菌群會(huì)逐漸成為優(yōu)勢(shì)種群, 最后也將導(dǎo)致藥物完全失效[26]。(2)用藥濃度偏低。在藥源不足時(shí), 養(yǎng)殖者錯(cuò)誤地認(rèn)為用比不用好, 因此在預(yù)防時(shí)期經(jīng)常低劑量使用, 或者與其他藥物混合使用導(dǎo)致可能出現(xiàn)拮抗作用降低藥效, 而低劑量藥物極易在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)菌群對(duì)相應(yīng)藥物產(chǎn)生耐藥性甚至多重耐藥性。(3)藥物施用不均勻。大部分水生細(xì)菌具有回避特性, 如施用不均勻可使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的可能性增大[27]。

4 結(jié)論

本次研究結(jié)果表明, 來(lái)源于牡蠣養(yǎng)殖環(huán)境水體及其體內(nèi)的異養(yǎng)菌多重耐藥比例較高, 值得引起注意。受試菌株對(duì)不同藥物的抗性存在較大差異, 其中牡蠣養(yǎng)殖水體菌及正常體內(nèi)異養(yǎng)菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率最低, 其次為慶大霉素; 病牡蠣體內(nèi)細(xì)菌對(duì)慶大霉素的耐藥率最低, 其次為復(fù)合磺胺和恩諾沙星?？傮w看來(lái), 異養(yǎng)細(xì)菌對(duì)呋喃唑酮的耐藥率明顯高于對(duì)其他受測(cè)抗生素的耐藥率, 而不同月份來(lái)源的菌株對(duì)青霉素和利福平的耐藥率波動(dòng)較大; 從時(shí)間動(dòng)態(tài)上看, 水體菌耐藥率峰值出現(xiàn)于4月份, 而牡蠣體內(nèi)菌群耐藥率峰值出現(xiàn)于7月份。

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Study on antibiotic resistance of bacteria in oysters and their farming water

WANG Rui-xuan1, LI Bing2, LIN Hua-jian3, CHEN Qi4, CHEN Xiu-cheng2, 5, MOU Hong-li2, WANG Jiang-yong2

(1. Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 3.Guangdong Provincal Aquatic Animal Epidemic Disease Prevention and Control Center, Guangzhou 511400, China; 4. South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 5. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

To understand the resistance to antibiotics of bacteria in and out of oysters, 10 types of antibiotic susceptibility tests were performed on 637 heterotrophic bacteria isolated from oysters and their farming water in Yangjiang. The Kirby-Bauer paper diffusion method (K-B method) was used to analyze the general situation of bacterial resistance to different antibiotics according to the NCCLS antibiotic sensitivity test operating standards. The results showed that the antibiotic resistance rates of heterotrophic bacteria from healthy oysters to enoxacin and gentamicin were low. The antibiotic resistance rate for heterotrophic bacteria from diseased oysters to gentamicin was the lowest, followed by that to the compounds sulfonamide and enoxacin. The antibiotic resistance rates for bacteria from farming water to chloramphenicol, enoxacin, and ciprofloxacin were low; however, the antibiotic resistance rate of bacteria from oysters and farming water to furazolidone was the highest among 10 tested antibiotics, and the sensitivity rates to kanamycin and penicillin were fickle. The present results also suggested that the multi-antibiotic resistance rate was significant. The multi-antibiotic resistance rate of strains from healthy oysters and diseased oysters peaked at 66.7% and 64.3%, respectively, in July, and the multi-antibiotic resistance rate of the strains from the farming water peaked at 76.7% in April. In general, the results of this study indicated that the multi-antibiotic resistance rate of heterotrophic bacteria from the farming environmental water and oysters were all high, which should be a concern. The resistance of the tested strains to different antibiotics varied significantly, and the resistance rate to furazolidone was significantly higher than that of other tested antibiotics. In terms of time dynamics, the peak of antibiotics resistance rate of farming water-derived bacteria and oyster-derived bacteria occurred in April and July, respectively.

; heterotrophic bacteria;; antibiotics; resistance

Dec. 10, 2019

P745.26

A

1000-3096(2020)06-0056-08

10.11759/hykx20191210001

2019-12-10;

2020-02-29

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017A030313112); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-49); 廣東省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略專項(xiàng)(粵財(cái)農(nóng)[2019]73號(hào)); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31902416)

[Natural science foundation of Guangdong province, No.2017A030313112; Special funds for the construction of modern agricultural industrial technology system, No.CARS-49; Guangdong province rural revitalization strategy special project, No.Yuecai nong [2019] no. 73; National Natural Science Foundation of China, No.31902416]

王瑞旋(1979-), 女, 廣東揭陽(yáng)人, 副研究員, 博士, 主要從事水生生物病害防治研究, E-mail: wangruixuan@scsfri.ac.cn; 王江勇,通信作者, 電話: 020-89108321, E-mail: wjy104@163.com

(本文編輯: 康亦兼)