黃天悅，高 鵬，王 進，張旭松，陳 斐，陳孝平

武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，湖北 武漢 430205

γ-聚谷氨酸（γ-poly-glutamicacid，γ-PGA）是一種天然陰離子生物多肽，分子量為1 萬～2 萬，其通常由L-谷氨酸（L-Glu）和D-谷氨酸（D-Glu）通過α-氨基和γ-羧基間的酰胺鍵連接而成［1-3］。γ-PGA 具有極佳的水溶性、生物親和性和生物降解性，其吸附性也十分優(yōu)異，其可作為藥物增效劑、癌癥靶向藥載體或基因載體廣泛應用于醫(yī)藥行業(yè)，其增稠性極佳可作為食品工業(yè)中的增稠劑、營養(yǎng)助劑和風味添加劑，除此也廣泛應用于化妝品研制、污水吸附處理、重金屬土壤治理等諸多方面［4-6］。在農(nóng)業(yè)方面，亦可作為肥料增效劑、緩釋劑和穩(wěn)定劑，更可保持土壤水分同時吸附土壤中的陽離子來增強耕作土壤肥力，能有效改善土壤團粒結(jié)構(gòu)促進農(nóng)作物生長，提高農(nóng)作物的抗逆性［7-9］。

γ-PGA 最早發(fā)現(xiàn)于炭疽芽孢桿菌中，Troy 等［10］發(fā)現(xiàn)它是一種易溶于水的酰胺類化合物，可通過芽孢桿菌及其變種的次級代謝產(chǎn)物中獲取。目前生產(chǎn)γ-PGA 常用的方法有化學法、酶轉(zhuǎn)化法、物理提取法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法因其生產(chǎn)條件簡單、周期短、產(chǎn)量大、目標產(chǎn)物分子量適宜應用最為普遍。但由于γ-PGA 的產(chǎn)出率低且缺乏低廉的提取工藝等原因，導致γ-PGA 產(chǎn)量偏低，嚴重影響了γ-PGA 在我國的大規(guī)模應用。近年來采用基因工程改造菌株和響應面優(yōu)化培養(yǎng)基使得γ-PGA 的產(chǎn)量逐年提高［11］。王增等［12］利用基因組重組技術(shù)由枯草芽孢桿菌GXA-28 出發(fā)獲得了突變株F3-178，其突變菌株中γ-PGA 相關合成基因的過度表達使得γ-PGA 產(chǎn)量提高了1.9 倍［（34.3±1.2）g/L］，發(fā)現(xiàn)基因組重組技術(shù)可用于快速改良γ-PGA 產(chǎn)生菌株并有效提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量。曹小紅［13］等利用Plackett-Burman 設計和響應面分析Box-Behnken 設計法對產(chǎn)γ-PGA 發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，通過顯著因素篩選和多元二次回歸方程擬合三個顯著因素與γ-PGA 產(chǎn)量之間的函數(shù)關系對回歸方程進行分析后獲得最優(yōu)工藝參數(shù)，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基下γ-PGA 的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了34.01%。

鑒于化肥過度使用造成的眾多環(huán)境問題，我國農(nóng)業(yè)實踐正朝著開發(fā)環(huán)境友好型氮肥方向轉(zhuǎn)變。γ-PGA 對土壤微生物群落和作物氮素吸收具有良好的促進作用，γ-PGA 可明顯提高化肥利用率，將γ-PGA 添加到化肥中施用，可減少化肥施用量20%，減少化肥施用對環(huán)境的壓力［14］。此外，γ-PGA 及其增效肥與同類聚丙烯酸、聚天冬氨酸等目前已經(jīng)大量開發(fā)的肥料促進劑相比，其在具備減緩施用肥料流失、抗旱保墑、抗病增產(chǎn)等功效的同時，兼具成本低、使用便捷等優(yōu)勢［15］。褚群等［15］研究發(fā)現(xiàn)γ-PGA 對培養(yǎng)基質(zhì)的理化性狀和番茄生長均有促進作用，施用后顯著提高基質(zhì)的持水孔隙度、最大持水量、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷、速效鉀、交換性鎂含量，降低培養(yǎng)介質(zhì)EC 值、通氣孔隙大小和pH 值，促進了番茄穴盤苗生長發(fā)育后期基質(zhì)中過氧化氫酶活和中性磷酸酶活，且作用效應隨著添加量的增高而顯著增強。Jiang 等［16］也發(fā)現(xiàn)采用γ-PGA 包被尿素可以有效減緩尿素的溶解，與未經(jīng)處理的尿素相比利用其制備的3 種γ-PGA 尿素復合肥均可使花期的番茄葉綠素含量增加100%，且土壤分析結(jié)果表明施用復合肥后的盆栽土壤中銨態(tài)氮含量比尿素處理后的盆栽土壤高25%～61%，而番茄收獲后，硝態(tài)氮含量低近50%，證明γ-PGA 尿素復合肥能促進作物對氮的吸收，減少了施氮量的損失。除對番茄，γ-PGA 及其所制備的復合肥均對辣椒、小白菜［17］、甘藍、水稻［18］、柑橘［19］等作物的生產(chǎn)都有促進作用，但相關研究以土壤施用居多葉面噴施的研究較少［20-21］。

本實驗通過響應面法對實驗室分離提取的一株高產(chǎn)γ-PGA 枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵優(yōu)化以提高γ-PGA 的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，然后對發(fā)酵產(chǎn)物進行分離提純與尿素復配制備復合葉面肥，研究其噴施后對于辣椒幼苗表觀形態(tài)和生理指標以及成株產(chǎn)量的影響，以期為γ-PGA 葉面肥的研制和施用提供基礎。

1 實驗部分

1.1 材 料

菌種：高產(chǎn)γ-PGA 枯草芽孢桿菌由實驗室分離保存。

試劑：酵母粉、瓊脂、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、黃豆粉、玉米漿、大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉、淀粉、纖維素、丙三醇（甘油）、L-谷氨酸、L-谷氨酸鈉、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2、FeCl3·6H2O、（NH4）2SO4、（NH4）2CO3、NH4NO3、NaNO3、尿素、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB），以上試劑均為分析純。

γ-PGA（70 kD）標準品（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、明膠18.0～25.0 g/L，將pH調(diào)至7.0～7.2，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L 以及蔗糖1.0 g/L，將pH 調(diào)至7.0～7.2，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：L-谷氨酸鈉25.0 g/L、檸檬酸鈉16.8 g/L、蔗糖20.0 g/L、NH4Cl 7.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L、CaCl20.15 g/L、FeCl3·6H2O 0.04 g/L，將pH 調(diào) 至7.0～7.2，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

1.3 方 法

1.3.1 培養(yǎng)方法 菌種活化：由實驗室-20 ℃保藏菌種的冷凍甘油管中取1 環(huán)菌種接入斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色鏡檢無誤后用作活化菌種。

種子培養(yǎng)：取1 環(huán)活化后單菌落中的菌體接種于種子培養(yǎng)基（250 mL 三角瓶裝液量為50 mL），200 r/min，37 ℃，恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。

搖瓶發(fā)酵：加入250 mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，種子液以質(zhì)量分數(shù)3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃，恒溫震蕩培養(yǎng)72 h。

1.3.2 發(fā)酵液中γ-PGA 的檢測 利用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）溶液與γ-PGA 反應可產(chǎn)生渾濁的特性，通過酶標儀測定反應體系的250 nm 吸光度來反映其濁度，進而通過濁度與γ-PGA 標準品的濃度線性方程y=0.033 5x-0.151 9 計算發(fā)酵液中γ-PGA 的含量，可快速準確地測定發(fā)酵液中γ-PGA 的含量［22］。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 單因素試驗：探究以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、纖維素作為單一碳源時γ-PGA 的產(chǎn)量，確定最佳碳源后進行爬坡實驗。以不加氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加6 g/L 的酵母膏、黃豆粉、玉米漿、大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨、尿素、氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、硝酸銨、硝酸鈉，其他營養(yǎng)成分不變，來探究不同氮源對于γ-PGA 的產(chǎn)量的影響，確定最佳氮源后進行爬坡實驗。以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，分別添加0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 g/L 的L-谷氨酸鈉，其他條件相同，探究發(fā)酵前體L-谷氨酸鈉濃度對γ-PGA 產(chǎn)量的影響。每組均做10 個平行對照重復3 次。

響應面優(yōu)化實驗：在單因素實驗的基礎上，選取最佳碳源、最佳氮源及谷氨酸鈉三個因素為自變量，以γ-PGA 產(chǎn)量為響應值，利用Design Expert 8.0 軟件設計三因素三水平的響應面實驗（表1）。采用Box-Behnken 實驗設計來評價各項指標與因素間的非線性關系，實驗組合數(shù)少、準確經(jīng)濟。逐因子試驗法，采用Design Expert 8.0 軟件進行實驗分析和響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件。

表1 響應面因素水平表Tab.1 Response surface factors levels table g/L

1.3.4 γ-PGA 復合葉面肥對辣椒生長及產(chǎn)量的影響 田間小區(qū)試驗于2018 年進行，試驗地點位于武漢工程大學流芳校區(qū)，試驗土壤全氮含量1.23 g/kg，全磷含量12.72 g/kg，全鉀含量17.61 g/kg，有機質(zhì)含量31.98 g/kg，速效磷含量20.39 g/kg，速效鉀含量20.72 g/kg，pH 7.25。供試γ-PGA 為實驗最佳發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵后所制備純化所得的γ-PGA凍干粉劑。

試供辣椒（Capsicum annuum L.）品種為薄皮王-3 F1 大果早豐薄皮辣椒（宜昌市比亞久種業(yè)有限公司）。田間小區(qū)試驗于2018 年進行，試驗辣椒于2 月28 日采用128 孔穴盤進行加溫育苗，3 月28日定植根系滿穴的植株，采用單株定植方式：底肥為有機肥1 800 kg/hm2，以及魔肥150 kg/hm2。

試驗設7 個處理，分別為：

1）清水（CK）；

2）10 g/L 尿素稀釋液；

3）10 g/L 尿素+0.2 g/L γ-PGA 稀釋液；

4）10 g/L 尿素+0.4 g/L γ-PGA 稀釋液；

5）10 g/L 尿素+0.6 g/L γ-PGA 稀釋液；

6）10 g/L 尿素+0.8 g/L γ-PGA 稀釋液；

7）10 g/L 尿素+1.0 g/L γ-PGA 稀釋液。

尿素與γ-PGA 復合葉面肥（γ-PGA-compound foliar fertilizer，γ-PGA-SCU），每組處理重復3 次，每組重復20 株，處理間設置保護行各處理田間管理一致，在4 月1 日進行第一次肥料噴施葉面，以后每隔7 d 噴施1 次，共噴施葉面肥料液8 次。

于定植后30 d 和60 d 時測定辣椒幼苗的表觀形態(tài)和各項生理指標。每組重復隨機取10 株幼苗，分別用直尺和游標卡尺測定辣椒株高和莖粗，掃描儀（Scan Maker i800）掃描和LA-S 葉面積分析系統(tǒng)測定葉面積，稱重法測定莖葉、根鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量，壯苗指數(shù)=（莖粗/株高）×全株干重。氯 化 三 苯 基 四 氮 唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）還原法測定根系活力，葉綠素儀（Chlorophyll meter，SPAD-502Plus）測定最新完全展開葉片的SPAD 值，每組重復隨機取樣10 株。試驗數(shù)據(jù)采用DPS 7.05 和Excel 2016 軟件進行統(tǒng)計分析。

辣椒果實成熟后，每組重復隨機取10 株辣椒苗測定其農(nóng)藝性狀產(chǎn)量（單果重、單株掛果數(shù)、單株產(chǎn)量含量），試驗數(shù)據(jù)采用DPS 7.05 和Excel 2016 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對γ-PGA 產(chǎn)量的影響

通常以檸檬酸和甘油作為復合碳源來進行γ-PGA 的微生物發(fā)酵培養(yǎng)，按原有發(fā)酵培養(yǎng)配方γ-PGA 產(chǎn)出率較低。本實驗研究以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、纖維素作為單一碳源時γ-PGA 的產(chǎn)量。碳源添加量為30 g/L，其他營養(yǎng)成分不變，結(jié)果如表2 所示。當發(fā)酵培養(yǎng)中不額外添加碳源時，菌體以谷氨酸鈉為營養(yǎng)物質(zhì)生長較差，所產(chǎn)γ-PGA 量少。以蔗糖作為唯一碳源時γ-PGA 的產(chǎn)量最高為19.14 g/L，此時菌體生長狀況也最好，故選擇蔗糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

設置不同梯度濃度的蔗糖作為唯一碳源進行爬坡實驗，探究不同蔗糖濃度對γ-PGA 產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖1 所示，發(fā)酵液中γ-PGA 的產(chǎn)量先隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加而升高，當蔗糖的添加量為40 g/L 時γ-PGA 產(chǎn)量達到峰值，當發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖的濃度超過40 g/L 后發(fā)酵液中γ-PGA 的產(chǎn)量不再隨著蔗糖濃度的增加而升高趨于一個定值。

2.2 不同氮源對γ-PGA 產(chǎn)量的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加6 g/L的酵母膏、黃豆粉、玉米漿、大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨、尿素、氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、硝酸銨、硝酸鈉，其他營養(yǎng)成分不變。結(jié)果如表3 所示，相較于大多數(shù)無機氮源有機氮源能更為有效地促進發(fā)酵過程中高產(chǎn)γ-PGA 枯草芽孢桿菌的生長，其中采用玉米漿和胰酪蛋白胨為唯一氮源時細菌生長量均達到較高水平，但發(fā)酵產(chǎn)物γ-PGA 的產(chǎn)量僅黃豆粉作為唯一氮源時較高為19.32 g/L。無機氮源相對于有機氮源價格更為低廉，采用硫酸銨作為唯一氮源時發(fā)酵液中細菌生長量較高其目標產(chǎn)物收率也最高為23.91 g/L，綜合考慮最佳氮源選擇硫酸銨為宜。

表2 不同碳源對γ-PGA 合成的影響Tab.2 Effect of different carbon sources on yeild of γ-PGA

圖1 蔗糖質(zhì)量濃度對γ-PGA 產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of sucrose mass concentration on yeild of γ-PGA

繼而選擇不同濃度的硫酸銨作為唯一氮源進行發(fā)酵，考察不同濃度的硫酸銨對γ-PGA 產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖2 所示，發(fā)酵液中γ-PGA 的產(chǎn)量隨著硫酸銨濃度在一定范圍內(nèi)的增加而升高，當在硫酸銨的添加量為7 g/時γ-PGA 產(chǎn)量最高，當發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸銨的濃度超過7 g/L 后發(fā)酵液中γ-PGA 的產(chǎn)量隨著硫酸銨濃度的增加而減少。

圖2 硫酸銨質(zhì)量濃度對γ-PGA 產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of ammonium sulphate mass concentration on yeild of γ-PGA

2.3 L-谷氨酸鈉對γ-PGA 產(chǎn)量的影響

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，分別添加0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 g/L 的L-谷氨酸鈉，其他條件相同，考察L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對γ-PGA 產(chǎn)量的影響。

結(jié)果如表4 和圖3 所示，不同質(zhì)量濃度的L-谷氨酸鈉對γ-PGA 的發(fā)酵生產(chǎn)有很大影響，當谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為10～80 g/L 時γ-PGA 的產(chǎn)量隨L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度升高而迅速地升高，當超過了80 g/L 時產(chǎn)量增速放緩，在添加量為80 g/L 時γ-PGA 產(chǎn)量最高為63.57 g/L。當L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為80～120 g/L 時γ-PGA 的產(chǎn)量隨著L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度升高而下降，過高質(zhì)量濃度的L-谷氨酸鈉抑制細菌進一步產(chǎn)生γ-PGA。

表3 不同氮源對γ-PGA 合成的影響Tab.3 Effect of different nitrogen sources on yeild of γ-PGA

表4 L-谷氨酸鈉對γ-PGA 合成的影響Tab.4 Effect of sodium hydrogen glutamate on yeild of γ-PGA

圖3 L-谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度對于γ-PGA 的產(chǎn)量及細菌生長量A660的影響Fig.3 Influence of mass concentration of sodium hydrogen glutamate on yield of γ-PGA and growth of bacteria A660

2.4 響應面實驗結(jié)果

2.4.1 模型建立與方差分析 采用Design Expert8.0軟件對實驗結(jié)果（表5）進行回歸分析和方差分析（表 5），得到的回歸方程為：Y=63.76-2.08A+20.42B-5.10C+0.74AB-4.33AC-1.00BC-1.46A2-27.93B2-2.36C2，其中Y 為γ-PGA 產(chǎn)量的預測響應值，A，B，C 分別為蔗糖、谷氨酸鈉、硫酸銨的編碼值。

表5 Box-Behnken 試驗設計結(jié)果Tab.5 Design results of Box-Behnken experiment

由表6 可得，回歸模型顯著，調(diào)整后的復相關系數(shù)R2為0.967 0，說明模型與實際實驗擬合程度較好。由表6 的回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果可知，模型的一次項A、B、C 均顯著，二次項AC、BC、A2、B2、C2也顯著，表明各因素對γ-PGA 產(chǎn)量的影響不是簡單的線性關系。對擬合得到的方程分析得到預測的最佳培養(yǎng)基組成：蔗糖60.39 g/L、硫酸銨6.00 g/L、谷氨酸鈉93.27 g/L，此時的γ-PGA產(chǎn)量為71.356 g/L。

2.4.2 響應面分析 借助Design Expert?Software Version 11 軟件，根據(jù)回歸模型作出相應的響應曲面和等高線圖。由兩因素交互等高線圖可以直觀地判斷兩因素的交互作用情況，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓則表示兩因素交互作用顯著。圖4 表明蔗糖和L-谷氨酸鈉對γ-PGA 的交互作用比較顯著，γ-PGA 的產(chǎn)量隨蔗糖和L-谷氨酸鈉的添加量的增加先逐漸增大后減小，說明過高質(zhì)量濃度的蔗糖和L-谷氨酸鈉均對γ-PGA 的產(chǎn)生起抑制作用。由圖5 看出蔗糖和硫酸銨對γ-PGA的交互作用十分顯著，且γ-PGA 含量隨著蔗糖和硫酸銨的添加量的增加同樣呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。圖6 則表明隨著L-谷氨酸鈉添加量的增加γ-PGA 的產(chǎn)量先增后減，當發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸銨的添加量為1～8 g/L 時，γ-PGA 的產(chǎn)量先增后減，存在最大值。

表6 響應面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Tab.6 Variance analysis results for response surface quadratic regression model equation

2.4.3 最優(yōu)培養(yǎng)基的確定 通過對回歸方程進行數(shù)學分析得出，最佳培養(yǎng)基組成為：蔗糖60.39 g/L、硫酸銨6.00 g/L、谷氨酸鈉93.27 g/L，此時的γ-PGA 產(chǎn)量為71.356 g/L。按照優(yōu)化的培養(yǎng)基組成做驗證實驗，平行實驗3 次取平均值，結(jié)果為70.285 g/L，與預測值僅相差1.42%，比優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基的γ-PGA 產(chǎn)量（7.253 g/L）提高約9.69倍，因此用響應面法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化是一種切實可行的方法。

圖4 蔗糖與L-谷氨酸鈉交互作用：（a）等高線圖，（b）響應面圖Fig.4 Interaction between sucrose and sodium hydrogen glutamate：（a）contour map，（b）response surface

圖5 蔗糖與硫酸銨交互作用：（a）等高線圖，（b）響應面圖Fig.5 Interaction between sucrose and ammonium sulfate：（a）contour map，（b）response surface

圖6 硫酸銨與L-谷氨酸鈉交互作用：（a）等高線圖，（b）響應面圖Fig.6 Interaction between ammonium sulfate and sodium hydrogen glutamate：（a）contour map，（b）response surface

2.5 γ-PGA 復合葉面肥對辣椒生長和產(chǎn)量的影響

圖7 噴施不同類型葉面肥對辣椒幼苗的影響：（a）葉片葉綠素含量，（b）根系活力Fig.7 Effect of different foliar fertilizers on pepper seedlings：（a）leaf chlorophyll，（b）root activity

2.5.1 γ-PGA 復合葉面肥對辣椒幼苗葉片葉綠素含量和根系活力的影響 γ-PGA 復合葉面肥的噴施改變了辣椒幼苗葉片葉綠素含量和根系活力。如圖7 所示，隨著復合葉面肥中γ-PGA 濃度的增加，辣椒幼苗葉片葉綠素含量顯著提高。特別是定植后60 d，各處理之間均達到了顯著差異水平（P ＜0.05）。γ-PGA 添加對辣椒幼苗根系活力的作用效果因辣椒幼苗發(fā)育階段表現(xiàn)出不同變化趨勢。在定植后30 d，辣椒幼苗根系活力隨復合葉面肥中γ-PGA 濃度增加而逐漸下降，作物幼苗的根系活力對于氮素的吸收具有高濃度抑制反饋效應，γ-PGA 作為復合葉面肥中的增效劑對于葉片的氮素吸收有促進作用，隨著葉面肥中γ-PGA 添加比例的增大辣椒幼苗對于氮素的吸收率更高，對于植株根系活力的抑制則更為明顯。至定植后60 d 辣椒苗為成熟植株，辣椒幼苗的根系活力在1-4 區(qū)間表現(xiàn)出顯著增加，而大于4 區(qū)間的各處理間并未表現(xiàn)出顯著差異。

2.5.2 γ-PGA 復合葉面肥對辣椒幼苗總體生長發(fā)育的影響 如圖8 所示，γ-PGA 復合葉面肥的噴施主要促進了辣椒幼苗上部莖葉的生長發(fā)育。在辣椒幼苗生長發(fā)育前期（定植后30 d）相比于空白對照噴施幼苗的株高、葉面積的增長促進顯著（P＜0.05），且增長效果隨著復合葉面肥中γ-PGA 濃度的增加而逐步提高，在復合葉面肥中γ-PGA 的添加量達到0.6 g/L 的時候?qū)τ诶苯酚酌缰旮呒叭~面積的增效影響達到頂峰。但其對于辣椒莖粗及莖葉干重的促進作用并不顯著。在辣椒幼苗生長發(fā)育的后期（定植后60 d），各項生理指標的差異性均達顯著水平（P ＜0.05），在復合葉面肥中γ-PGA的添加量達到0.6 g/L 的時候?qū)τ诶苯酚酌缰旮摺⑶o粗、葉面積及莖葉干重的增效影響達到頂峰。

圖8 噴施不同類型葉面肥對辣椒幼苗生長發(fā)育的影響：（a）株高，（b）莖粗，（c）葉面積，（d）莖葉干重Fig.8 Effect of different foliar fertilizers on growth of pepper seedlings：（a）plant height，（b）stem diameter，（c）leaf area，（d）dry weight of stem and leaf

而對于根系，如表7 在辣椒整個幼苗生育期其促進作用均不明顯，隨復合葉面肥中γ-PGA 添加量增加，根體積和根干重呈現(xiàn)出顯著降低的趨勢?？赡苁怯捎讦?PGA 復合葉面肥噴施促進了辣椒幼苗莖葉生長，抑制了根系生長，最終導致辣椒幼苗根冠比的降低。此外，γ-PGA 復合葉面肥的噴施還提高了辣椒幼苗生長發(fā)育前期（定植后30 d）壯苗指數(shù)。隨著辣椒幼苗進一步的生長發(fā)育，γ-PGA 逐漸提高辣椒幼苗莖粗和莖葉干物質(zhì)積累量，但辣椒幼苗的壯苗指數(shù)在各處理間并未有顯著差異。綜合來看γ-PGA 復合葉面肥的噴施顯苗的壯苗指數(shù)在各處理間并未有顯著差異。綜合來看γ-PGA 復合葉面肥的噴施顯著提高了辣椒幼苗株高、莖粗、葉面積、莖葉干重等地上部生長發(fā)育參數(shù)，降低了辣椒根系干重，與相關文獻中描述對于其他作物生產(chǎn)時添加的作用效果一致。

表7 不同類型葉面肥對辣椒幼苗根系的影響Tab.7 Effect of different foliar fertilizer on root of pepper seedlings

2.5.3 γ-PGA 復合葉面肥對辣椒果實發(fā)育的影響 如圖9 所示，γ-PGA 復合葉面肥的噴施能有效促進了辣椒果實的生長發(fā)育。在辣椒結(jié)果盛期，相比于空白對照辣椒的單果質(zhì)量、果實最大圍直徑（果粗）、掛果數(shù)、單果質(zhì)量均隨著復合葉面肥中γ-PGA 的含量增加而增大，當復合葉面肥中γ-PGA的質(zhì)量濃度為0.6 g/L 辣時椒單果質(zhì)量最大，為12.07 cm，而當復合葉面肥中γ-PGA 的含量繼續(xù)增加時辣椒果實長度增加并不明顯達到平臺值。當復合葉面肥中γ-PGA 的質(zhì)量濃度為0.8 g/L 辣時椒單果果粗最大，為11.25 cm，而當復合葉面肥中γ-PGA 的含量繼續(xù)增加時辣椒單果果粗增加并不明顯達到平臺值。當復合葉面肥中γ-PGA 的質(zhì)量濃度為0.6 g/L 辣時椒單果掛果量最大為9 個，而當復合葉面肥中γ-PGA 的含量繼續(xù)增加時辣椒掛果量增加并不明顯達到平臺值。當復合葉面肥中γ-PGA 的質(zhì)量濃度為0.6 g/L 時辣椒單果質(zhì)量最大，為78.84 g，而當復合葉面肥中γ-PGA 的含量繼續(xù)增加時辣椒果實質(zhì)量增重并不明顯達到平臺值。當復合葉面肥中γ-PGA 的質(zhì)量濃度為0.6 g/L時辣椒單株產(chǎn)量最大，為788.40 g，而當復合葉面肥中γ-PGA 的含量繼續(xù)增加時辣椒單株產(chǎn)量增加并不明顯達到平臺值。

圖9 噴施不同類型葉面肥對辣椒果實的影響；（a）果長，（b）果粗，（c）掛果量，（d）果實重量，（e）單株產(chǎn)量Fig.9 Effect of different foliar fertilizerons yield and quality of pepper fruit：（a）fruit length，（b）thickness of fruit，（c）fruit number of plant，（d）fruit mass，（e）yield of plant

綜合來觀察，當噴施的復合葉面肥為10 g/L尿素+0.6 g/L γ-PGA 稀釋液時辣椒的總體果實品質(zhì)及發(fā)育情況最好產(chǎn)量也最高。

3 結(jié) 論

本研究利用響應面法對實驗室分離的一株高產(chǎn)γ-PGA 枯草芽孢桿菌進行優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在單因素優(yōu)化實驗的基礎上，通過響應面法對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖60.39 g/L、硫酸銨6.00 g/L、谷氨酸鈉93.27 g/L，γ-PGA 產(chǎn)量由原來的7.253 g/L 提高到70.285 g/L，完成了實驗室規(guī)模的發(fā)酵為后續(xù)制備γ-PGA 復合葉面肥提供大量的原材料。

分離提純后的γ-PGA 與尿素復配成γ-PGA 復合葉面肥能在苗期提高辣椒幼苗的多項生理指標。噴施復合葉面肥增加了辣椒葉片葉綠素含量、根系活力以及株高、莖粗和莖葉干重，且表現(xiàn)出明顯的劑量效應，能有效提高植株對氮肥的利用率，其中噴施10 g/L 尿素+0.6 g/L γ-PGA 最為適宜，在節(jié)約γ-PGA 用量的同時達到最佳增產(chǎn)效果。

肥料未來的發(fā)展方向是有機化和生物化。應用微生物制備有機肥料不僅可以減少因大量使用化學肥料對土壤結(jié)構(gòu)的破壞和水源的污染，還可以改善土壤肥力，有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。γ-PGA 的生物可降解性、環(huán)境友好性和保肥增效特性使其在生物有機肥料方面有重要的應用前景。