張 翔， 陳劉煒， 張全斌

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200072)

低溫治療是目前研究最深入、最有效的腦保護(hù)方法之一，已有多項(xiàng)研究證明了輕中度低溫(30～34℃)在缺血條件下的腦保護(hù)作用[1-3]。目前通過體表及血管內(nèi)方法進(jìn)行全身降溫已經(jīng)在急性缺血性卒中的治療中得到廣泛應(yīng)用[4-5]，但因?yàn)槠錆撛诘膰?yán)重不良反應(yīng)(凝血功能障礙，電解質(zhì)紊亂，誘發(fā)肺炎等)而使得臨床應(yīng)用受到較大限制。

針對(duì)全身降溫的缺點(diǎn)，選擇性動(dòng)脈內(nèi)灌注低溫生理鹽水引起了人們的關(guān)注，可以最大限度地發(fā)揮低溫治療的益處，同時(shí)避免全身降溫的不良反應(yīng)。通過這一方法在對(duì)急性顱內(nèi)大血管閉塞進(jìn)行開通時(shí)，低溫生理鹽水可直接灌注到缺血腦組織，能夠更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，同時(shí)低溫生理鹽水僅灌注到缺血腦組織，達(dá)到目標(biāo)溫度所需的液體量與全身血容量相比很小，因此對(duì)體溫的影響很小，進(jìn)而消除了全身降溫的不良反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)的缺血再灌注模型，模擬臨床對(duì)急性顱內(nèi)大血管閉塞進(jìn)行開通時(shí)行選擇性動(dòng)脈內(nèi)低溫治療，研究這一方式對(duì)大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的影響，并探究不同溫度低溫治療對(duì)腦保護(hù)能力的差異。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

選擇健康SD清潔級(jí)雄性大鼠24只，體重 240～300g，由同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，置于籠內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前禁食12h但不禁水。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組、模型組、4℃實(shí)驗(yàn)組、10℃實(shí)驗(yàn)組、20℃實(shí)驗(yàn)組、37℃實(shí)驗(yàn)組，每組4只。實(shí)驗(yàn)所使用動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法均依據(jù)國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及照顧相關(guān)方法，通過同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查。

1.2 方法

1.2.1 缺血模型構(gòu)建 按照傳統(tǒng)的線栓模型建模[6]。將雄性SD大鼠采用3%水合氯醛(1mL/100g)腹腔注射麻醉，采取頸部正中豎直切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈并分離翼腭動(dòng)脈。在頸內(nèi)動(dòng)脈近端備線，遠(yuǎn)端放置動(dòng)脈夾，頸總動(dòng)脈分叉處切口，插入專用栓線，避開翼腭動(dòng)脈，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)入顱至頸內(nèi)動(dòng)脈的分叉，阻斷大腦中動(dòng)脈血流來源，從頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處算起深度約17～20mm，傷口以碘伏消毒，縫合皮膚。此時(shí)大鼠如出現(xiàn)呼吸、心跳突然加快，部分大鼠出現(xiàn)尿失禁，是判斷栓塞成功的一個(gè)標(biāo)志。

1.2.2 再灌注處理 實(shí)驗(yàn)組將成功建模的大鼠在血流阻斷2h后再次麻醉，并將栓線抽出恢復(fù)血流，灌注生理鹽水則通過原先插入栓線的血管，經(jīng)留置針以0.6mL/min的速度滴生理鹽水，設(shè)置4種不同的水溫(4、10、20、37℃)，累計(jì)滴入6mL，完畢拔出針頭，測(cè)量實(shí)驗(yàn)鼠直腸溫度和腦內(nèi)溫度。模型組阻斷血流2h后將栓線抽出，實(shí)行血流再灌注，測(cè)量實(shí)驗(yàn)鼠直腸溫度和腦內(nèi)溫度。正常組不作任何處理，測(cè)量實(shí)驗(yàn)鼠直腸溫度和腦內(nèi)溫度。

1.2.3 溫度測(cè)量 腦溫測(cè)量點(diǎn)選取人字縫后1mm，旁開1mm處，深度約3mm，插入溫度探頭，連接測(cè)溫儀；肛溫測(cè)量采用體溫表測(cè)量大鼠直腸內(nèi)溫度。

實(shí)驗(yàn)組在灌注完生理鹽水后先測(cè)量1次溫度，然后每15min測(cè)量1次，共監(jiān)測(cè)5次，分別為0、15、30、45、60min的體溫。

1.2.4 神經(jīng)功能評(píng)分 觀察大鼠缺血再灌注建模48h后的神經(jīng)功能，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]建立的評(píng)分系統(tǒng)對(duì)大鼠缺血模型進(jìn)行神經(jīng)損傷評(píng)價(jià)，將大鼠缺血再灌注后出現(xiàn)的神經(jīng)癥狀分為0～4分。0分: 無神經(jīng)功能缺損；1分: 提尾時(shí)右前肢內(nèi)收，不能完全伸展；2分: 自發(fā)行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分: 行走時(shí)身體向右側(cè)傾倒；4分: 不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。

1.2.5 腦梗死體積測(cè)定 大鼠腦缺血48h后迅速處死并取出腦組織，置于0～4℃PBS溶液中轉(zhuǎn)移，于-20℃冰箱冷凍30min。除去小腦、嗅球和低位腦干。切取冠狀位腦片，厚度為2mm，將腦片放入2%紅四氮唑溶液中，37℃水浴30min，每5min輕微晃動(dòng)容器，使充分染色。取出腦片用PBS溶液洗滌3～5min，再用10%中性甲醛固定腦片6h。正常腦組織表現(xiàn)為深紅色，缺血腦組織表現(xiàn)為蒼白色，使用數(shù)碼相機(jī)拍攝，使用Image-pro Plus 6.0(Media Cyber-netics, Inc., Rockville, MD, USA)軟件進(jìn)行圖像處理，對(duì)每張照片進(jìn)行分析并計(jì)算得出梗死面積百分比。

1.2.6 血腦屏障通透性改變檢測(cè) 在恢復(fù)灌注48h后，處死前1h，經(jīng)大鼠尾靜脈注入2%的伊文思藍(lán)(Evans blue, EB)(4mL/kg)，1h后經(jīng)心臟灌注預(yù)冷的生理鹽水直至右心房流出清亮液體時(shí)，快速取缺血腦組織，稱濕重后放入5mL甲酰胺溶液中，45℃ 水浴24h后離心取上清液，使用酶標(biāo)儀測(cè)定其630nm 處的吸光度值(A630)，以甲酰胺溶液做空白比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品EB含量。

1.2.7 透射電鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化 再灌注48h后的大鼠麻醉，采用4℃生理鹽水200mL，經(jīng)心臟快速灌注，待右心耳流出清亮液體時(shí)，再用2%戊二醛和4%多聚甲醛混合液灌注固定，剖取缺血側(cè)半球額頂區(qū)皮質(zhì)，大小約1mm×1mm×1mm，2.5%戊二醛固定24h，1%鋨酸固定1h，脫水等常規(guī)透射電鏡樣品制備，超薄切片(片厚60nm)鈾鉛雙染，加速電壓80kV，透射電鏡(×20000)下觀察血腦屏障結(jié)構(gòu)并攝片。

1.2.8 ELISA法檢測(cè) 大鼠S100β蛋白含量實(shí)驗(yàn)組、模型組及正常組大鼠于建模48h后采集右心室靜脈血，將血標(biāo)本于室溫下離心半徑8cm，2000r/min，離心15min后，取上清液進(jìn)行測(cè)量，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)S100β蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)間比較使用t檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型的建立

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中共采用24只SD雄性大鼠，建模過程中無實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。建模完成后，各組大鼠腦溫變化可見灌注剛結(jié)束及灌注結(jié)束15min時(shí)，4℃ 實(shí)驗(yàn)組的大鼠腦溫顯著低于其他組(0min:F=6.53,P=0.01；15min:F=3.55，P=0.02)，見表1。其余時(shí)間點(diǎn)各組大鼠間的腦溫差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間大鼠肛溫差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.2 選擇性動(dòng)脈內(nèi)低溫對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能評(píng)分的影響

大鼠缺血再灌注建模48h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，發(fā)現(xiàn)除正常組外，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都有明顯的神經(jīng)功能缺損，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.78，P=0.55)，見圖1。

表1 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的腦溫變化Tab.1 Comparison of cerebral temperature in different groups (℃)

表2 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的肛溫變化Tab.2 Comparison of rectal temperaturein different groups (℃)

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分Fig.1 Comparison of neurological function scores in different groups

2.3 選擇性動(dòng)脈內(nèi)低溫對(duì)大鼠腦梗死體積的影響

大鼠缺血再灌注建模48h后，4℃及10℃實(shí)驗(yàn)組的梗死體積相對(duì)模型組的梗死體積顯著縮小(4℃vs模型組:P=0.012；10℃vs模型組:P=0.0086)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 各組大鼠腦梗死體積比較Fig.2 Comparison of infarction volume in different groups大鼠缺血再灌注建模48h后，與模型組相比，*P<0.05

2.4 選擇性動(dòng)脈內(nèi)低溫對(duì)大鼠血腦屏障通透性的影響

各組大鼠EB含量測(cè)定后顯示，模型組及不同溫度實(shí)驗(yàn)組對(duì)于EB的通透性明顯高于正常組(F=2.838，P=0.025)，與模型組相比，4℃實(shí)驗(yàn)組的EB通透性顯著性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。其余各溫度實(shí)驗(yàn)組對(duì)EB的通透性與模型組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(10℃vs模型組P=0.136;20℃vs模型組P=0.730；37℃vs模型組P=0.931)，見圖3。

圖3 各組大鼠EB含量比較Fig.3 Comparison of EB level in different groups與正常組相比，*P<0.05

2.5 透射電鏡觀察低溫生理鹽水灌注對(duì)各組大鼠血腦屏障破壞的影響

正常組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核膜、核仁形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)密度均一，內(nèi)皮細(xì)胞基膜清晰，厚薄均勻，緊密連接結(jié)構(gòu)完好。模型組毛細(xì)血管明顯變形，管腔狹窄，血管周圍見大片電子空白區(qū)，內(nèi)皮細(xì)胞大量溶解，殘存的線粒體空泡變性，多出基膜片狀溶解、斷裂，緊密連接融合、擴(kuò)張。4℃組血管周圍無電子空白區(qū)，毛細(xì)血管基膜有斷裂現(xiàn)象，血管厚薄不均；10℃、20℃和37℃組仍可見電子空白區(qū)，毛細(xì)血管基膜有溶解、斷裂現(xiàn)象，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體空泡變性，緊密連接融合、擴(kuò)張；從電子空白區(qū)、血管基膜完整性、緊密連接和線粒體的變化程度對(duì)比，這3組的病理變化加重，見圖4。

圖4 各組大鼠透射電鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化(×20000)Fig.4 Comparison of the ultrastructure of blood-brain barrier shown by transmission electron microscopy in different groups

2.6 選擇性動(dòng)脈內(nèi)低溫對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注后血清S100β蛋白的影響

缺血再灌注建模后，模型組中的大鼠血清中S100β蛋白濃度顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；經(jīng)過不同溫度的生理鹽水治療后血清中S100β蛋白濃度均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=293.3,P<0.001)；其中4℃生理鹽水灌注組的S100β蛋白濃度最低，見圖5。

圖5 各組大鼠血清S100β蛋白濃度變化Fig.5 Comparison of S100β in different groups與正常對(duì)照組相比，*P<0.001；與模型組相比，*P<0.01

3 討 論

選擇性動(dòng)脈內(nèi)滴注低溫生理鹽水是一種高效的低溫的方式，相比其他低溫方式，它的降溫速度更快，效率更高[7-9]。同時(shí)，這種方式又能夠延長急性缺血性卒中的治療時(shí)間窗，并能與其他治療措施相結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過選擇性動(dòng)脈內(nèi)低溫對(duì)缺血腦組織灌注低溫生理鹽水能快速降低腦溫，減少腦梗死的體積，穩(wěn)定血腦屏障，并能減少血清S100β蛋白的表達(dá)，減輕腦組織損傷，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

Konstas等[10]研究顯示，選擇性動(dòng)脈內(nèi)滴注低溫生理鹽水，能夠在10min內(nèi)實(shí)現(xiàn)局部的低溫。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在選擇性滴注生理鹽水后，在0和15min時(shí)，4℃實(shí)驗(yàn)組的大鼠腦溫顯著低于其他組，表明選擇性動(dòng)脈滴注低溫生理鹽水能夠迅速地降低腦溫，4℃的生理鹽水具有更強(qiáng)的降溫效應(yīng)。同時(shí)，在灌注低溫生理鹽水時(shí)，各組大鼠的肛溫沒有發(fā)生明顯變化，表明選擇性動(dòng)脈內(nèi)滴注低溫生理鹽水能夠快速降低局部的腦溫，而對(duì)全身體溫的影響很小，一定程度上可以避免全身低溫的不良反應(yīng)。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在腦缺血后即刻，微血栓形成和血腦屏障破壞就已經(jīng)發(fā)生了[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然選擇性動(dòng)脈內(nèi)持續(xù)降低腦溫的時(shí)間相對(duì)較短，但足以起到腦保護(hù)的作用，這可能與即刻血管內(nèi)低溫對(duì)于微血栓的沖刷以及穩(wěn)定血腦屏障有關(guān)。

既往研究表明低溫能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的激活并抑制其蛋白水解活性[12]，減少血腦屏障的破壞，同時(shí)也能抑制水通道開放，減輕腦水腫[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，低溫能夠調(diào)控透過血腦屏障的相關(guān)分子運(yùn)輸。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠缺血再灌注建模48h后，4℃及10℃實(shí)驗(yàn)組的梗死體積相對(duì)模型組的梗死體積顯著縮小(P=0.012，P=0.0086)，表明選擇性血管內(nèi)低溫治療可以減少梗死腦組織體積。同時(shí)通過對(duì)各組大鼠腦組織EB含量的測(cè)定顯示缺血發(fā)生后血腦屏障對(duì)于EB的通透性顯著升高，在恢復(fù)血流灌注同時(shí)采用4℃生理鹽水進(jìn)行灌注，其血腦屏障的保護(hù)作用明顯優(yōu)于缺血對(duì)照組及其它溫度實(shí)驗(yàn)組。而透射電鏡的觀察結(jié)果也顯示4℃組的神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)最完整，損傷程度最低。既往研究表明，低溫可以通過降低鈣離子內(nèi)流，抑制興奮性毒性反應(yīng)，減少氧自由基生成，影響細(xì)胞凋亡，減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定血腦屏障等方式，起到腦保護(hù)的作用[14-16]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了低溫對(duì)于保護(hù)血腦屏障、減輕缺血及再灌注損傷，減少梗死體積具有顯著作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，選擇性動(dòng)脈滴注低溫生理鹽水能夠降低外周血清中S100β的含量。S100β是一種鈣結(jié)合蛋白，在腦組織中含量豐富，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)營養(yǎng)活性，主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)[17-18]。在血液和腦脊液中都可測(cè)得S100β的表達(dá)。在各種原因所致急性腦損傷(如急性顱腦外傷、顱內(nèi)出血、急性缺血性卒中等)，外周血清中S100β含量顯著升高，可作為腦損傷的生物標(biāo)志物[19-20]。一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)表明，急性腦梗死后患者血清S100β水平越高，腦梗死體積越大，功能預(yù)后越差[21]。在急性缺血/再灌注大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，降低血清中S100β的濃度，能夠改善大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，降低梗死體積，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[22]。另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，抑制S100β表達(dá)可減輕大鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞后梗死體積的擴(kuò)大以及改善神經(jīng)功能缺損[23-24]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過不同溫度的生理鹽水治療后血清中S100β蛋白濃度均低于模型組(F=293.3,P<0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中4℃組的S100β蛋白濃度最低，表明選擇性動(dòng)脈內(nèi)低溫可以有效減少S100β的表達(dá)，從而起到降低腦損傷，保護(hù)腦組織的作用。

綜上所述，通過選擇性動(dòng)脈內(nèi)低溫技術(shù)對(duì)缺血腦組織灌注低溫生理鹽水能快速降低腦溫，減少腦梗死的體積，穩(wěn)定血腦屏障結(jié)構(gòu)，并能減少血清S100β蛋白的表達(dá)，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。且4℃的生理鹽水相比其他溫度的生理鹽水，具有更強(qiáng)的腦保護(hù)效應(yīng)。當(dāng)然，本研究各組樣本量較小，觀察時(shí)間有限，可能是研究中各組神經(jīng)功能評(píng)分無顯著性差異的主要原因之一，尚有待進(jìn)一步深入研究。