吳越 劉維

摘要 目的：采用網(wǎng)絡(luò)平臺藥理學的研究方法，對四妙丸（SMW）用于治療骨關(guān)節(jié)炎（OA）的藥理作用以及機制問題進行了研究和探討。方法：主要通過在TCMSP網(wǎng)絡(luò)平臺對四妙丸進行活性藥物成分的篩選、在DrugBank數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上進行了靶標的預(yù)測，應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建了化合物-靶點數(shù)據(jù)分析網(wǎng)絡(luò);在TTD及DisGenet進行數(shù)據(jù)庫的檢索，獲取了疾病的靶點;通過構(gòu)建韋恩圖，取得了疾病與活性藥物作用靶點的交集，得到了四妙丸治療OA的作用靶點;并對四妙丸進行了GO功能注釋功能通路注釋和KEGG通路富集分析;構(gòu)建了四妙丸中藥-成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：分析研究顯示共挖掘到了四妙丸中64種共同作用成分及163個潛在共同作用靶點，OA疾病989個成分及相關(guān)共同作用靶點，得到四妙丸-疾病共同靶點18個，共同信號作用的靶點主要富集于34個生物過程和26條信號通路上。結(jié)論：四妙丸中藥可能主要是通過調(diào)節(jié)PTGS2、TNF、AR等共同靶點，調(diào)控IL-17信號通路、TNF信號通路、松弛素、破骨細胞分化、松弛素等方式來抑制機體炎性反應(yīng)，進一步調(diào)節(jié)機體免疫功能來治療骨關(guān)節(jié)炎。

關(guān)鍵詞 四妙丸;網(wǎng)絡(luò)藥理學;骨關(guān)節(jié)炎;靶點;信號通路

Mechanism of Simiao Pills in Treatment of Osteoarthritis Based on Network Pharmacology

WU Yue1，2，LIU Wei1，2

（1 First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 Tianjin Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula and Syndrome Transformation Research，Tianjin 300193，China）

Abstract Objective：To study the mechanism of Simiao Pills in the treatment of osteoarthritis（OA），based on network pharmacology.Methods：By screening the active ingredients of Simiao Pills on TCMSP platform，the target in the database of drugbank was predicted.Cytoscape 3.7.1 software was used to construct the compound-target data analysis network; the database was searched in TTD and DisGenet to obtain the target of the disease; the Venn diagram was constructed to obtain the intersection of the target of the disease and the active drug.The target of Simiao Pill in the treatment of OA was obtained; GO function annotation functional pathway annotation and KEGG pathway enrichment analysis were performed on Simiao Pill; a network of Simiao Pill Chinese medicine-component-target-signaling pathway was constructed.Results：The research showed that 64 components and 163 potential targets in Simiao Pills，989 related targets in OA disease，and 18 common targets in Simiao Pills disease were obtained，which were mainly concentrated in 34 biological processes and 26 signal pathways.Conclusion：Simiao Pills may be used for the treatment of osteoarthritis by regulating PTGS2，TNF，AR and other targets，regulating IL-17 signaling pathway，TNF signaling pathway，relaxin，osteoclast differentiation and other pathways，so as to inhibit inflammatory response etc.

Keywords Simiao Pills; Network pharmacology; Osteoarthritis; Target; Signal pathway

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.012

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）主要是以慢性軟骨關(guān)節(jié)炎和軟骨炎的局部病灶及慢性關(guān)節(jié)肌肉病變、軟骨關(guān)節(jié)下骨肥厚和慢性關(guān)節(jié)局部邊緣骨贅等為主要臨床發(fā)病病理特征的慢性肢體關(guān)節(jié)疾病，常伴有局部肌肉疼痛或關(guān)節(jié)無力、韌帶松弛、關(guān)節(jié)對線不良、輕度滑膜炎和關(guān)節(jié)半月板變性。2010年中國50歲以上的骨關(guān)節(jié)炎人口患病率達到25.3%[1]，在60歲以上的骨關(guān)節(jié)炎人群中大約每年有5 000萬人患有骨關(guān)節(jié)炎[2]，預(yù)計隨著亞洲人口年齡的進一步增長，亞洲骨關(guān)節(jié)炎患病率將進一步的上升，有相關(guān)研究人員預(yù)測，65歲以上人口的比例在未來30年將逐步翻番，從2008年的6.8%進一步上升甚至預(yù)計可能達到2040年的16.2%，使得社會的衛(wèi)生保健以及教育事業(yè)的發(fā)展面臨更嚴峻的挑戰(zhàn)[3]。本病主要屬于中醫(yī)“痹癥”“骨痹”范疇?，F(xiàn)代的研究結(jié)果表明，本病的發(fā)生與代謝異常、機械功能損傷、肥胖、及基因遺傳等一系列因素與有關(guān)[4-5]。我國現(xiàn)代醫(yī)學對于OA的診斷和治療主要目的是用于抗炎和調(diào)節(jié)骨代謝，常應(yīng)用非甾體抗炎藥、氨基葡萄糖、軟骨素、局部注射皮質(zhì)類固醇或透明質(zhì)酸、外用制劑及手術(shù)等進行骨關(guān)節(jié)的治療[6]。此外，關(guān)于骨關(guān)節(jié)炎的治療，現(xiàn)代中醫(yī)藥不僅有傳統(tǒng)辨證論治的特點，還有療效獨特且不良反應(yīng)較小的優(yōu)勢。但目前四妙丸對于OA的具體藥理作用和機制尚不明確，故嚴重限制了其臨床有效應(yīng)用和推廣。

四妙丸源自《成方便讀》，有清熱利濕的作用和功效，方中以黃柏為君，苦寒沉降，善除下焦?jié)駸?。方中以蒼術(shù)燥濕健脾和胃為臣。薏苡仁祛濕清熱瀉濁為佐。牛膝活血，亦可通調(diào)經(jīng)絡(luò)，善引藥下行，為佐、使藥。在OA中證屬于濕熱痹阻，臨床中可根據(jù)病情靈活應(yīng)用[7-8]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探討四妙丸治療OA的主要有效化合物、作用靶點、作用通路，從而進一步明確四妙丸治療OA的具體作用機制，為OA的臨床治療提供可能的思路。

1 材料與方法

1.1 四妙丸的主要成分及作用靶點的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[9]檢索出四妙丸中蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁等4種中藥的靶蛋白化合物。對靶蛋白化合物成分進行了篩選，其篩選的標準：中藥口服生物利用度（OB）篩選的閾值為OB≥30，化合物類藥性（DL）篩選的閾值為DL≥0.18。通過DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）[10]數(shù)據(jù)庫對化合物進行靶點預(yù)測，剔除數(shù)據(jù)庫不能預(yù)測到靶點的化合物，在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）[11]數(shù)據(jù)庫中將預(yù)測出的作用靶蛋白名轉(zhuǎn)換為作用靶點的簡稱，進行標準化的處理。

1.2 建立四妙丸化合物-靶點網(wǎng)絡(luò) 對預(yù)測出的化合物名稱進行編碼以便于分析和作圖。將化合物及其靶點數(shù)據(jù)輸入至Cytoscape 3.7.1[12]中，從而建立了中藥化合物—靶點網(wǎng)絡(luò);然后使用network analyzer工具進行網(wǎng)絡(luò)分析，通過自由度（Degree）判定節(jié)點的重要性，越高則代表越重要。

1.3 獲取骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點 在Therapeutic Target Database（TTD）（https：//db.idrblab.org/ttd/）[13]以及DisGenet（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/search）[14]數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“Osteoarthritis”，來獲取骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中得到靶點的簡稱，從而對其進行了標準化，并構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點的數(shù)據(jù)集。

1.4 篩選重要靶點及建立蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 運用Venny2.1作圖平臺（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），通過映射四妙丸有效化合物的靶點和骨關(guān)節(jié)炎病靶來構(gòu)建韋恩圖。其共同靶點可能是四妙丸治療骨關(guān)節(jié)炎的重要靶點。在STRING平臺（https：//string-db.org/）[15]導(dǎo)入所獲取的共同靶點，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，生物種屬選擇“Homo sapiens”，網(wǎng)絡(luò)參數(shù)設(shè)置為“molecular action”并將最低相互作用的閾值參數(shù)設(shè)置為“medium confidence”（>0.400），其他參數(shù)的設(shè)置保持默認。

1.5 重要靶點基因功能注釋和通路富集分析 應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件中的ClueGo插件[16]對共同靶點作GO功能注釋和KEGG通路富集分析，取P≤0.05的結(jié)果進行可視化分析，從而得到四妙丸治療骨關(guān)節(jié)炎可能的生物過程和信號通路。最后使用merge功能構(gòu)建四妙丸化合物-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 建立四妙丸化合物-靶點網(wǎng)絡(luò) 本研究得到四妙丸四味中藥的86種化合物，以及909個可能的相關(guān)靶點，靶點去重后有163個;其中有22個化合物沒有找到相關(guān)靶點，故未參與分析。最終在四妙丸中得到64種化合物，蒼術(shù)中有4種，黃柏中有25種，牛膝中有17種，薏苡仁中有18種。見表1。該網(wǎng)絡(luò)中含有227個節(jié)點和908個相互關(guān)系（見圖1）。“自由度”排名前三的化合物分別是槲皮素（Quercetin）（自由度值為75）、山柰酚（Kaempferol）（自由度值為44）、異延胡索單酚堿（Isocorypalmine）（自由度值為36）。

2.2 獲取共同靶點及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲取的骨關(guān)節(jié)炎989個疾病靶點與163個四妙丸化合物的作用靶點錄入韋恩圖在線繪制平臺，二者取完交集后獲得18個疾病-化合物共同靶點，該共同靶點在四妙丸治療骨關(guān)節(jié)炎中具有重要意義。見圖2。蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)共獲得18個相互作用節(jié)點和108條相互作用關(guān)系。見圖3。

2.3 GO功能注釋 本研究通過對18個共同靶點進行GO功能注釋，從而得到GO分析網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。其共同靶點主要富集在參與蛋白質(zhì)去乙?；恼{(diào)控（Regulation of Protein Deacetylation），細胞遷移參與新生血管生成（Cell Migration Involved in Sprouting Angiogenesis），急性炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)（Regulation of Acute Inflammatory Response），一氧化氮代謝過程（Nitric Oxide Metabolic Process），血管平滑肌細胞增殖（Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation），膠原分解的過程（Collagen Catabolic Process），等34個生物過程。這表明四妙丸對骨關(guān)節(jié)炎的治療可能通過細胞因子分泌調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激、蛋白降解、血管生成、組織重塑等。

2.4 KEGG通路富集分析 本研究對18個共同靶點進行KEGG通路分析，然后在omicshare（https：//www.omicshare.com/）在線平臺上對結(jié)果進行了可視化分析，得到KEGG分析氣泡圖。見圖5。共同靶點主要富集于TNF信號通路、破骨細胞分化、IL-17信號通路、弓形蟲病、恰加斯?。绹F蟲?。?、利什曼病、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、松弛素信號通路、FcεRI信號通路等26條通路。

2.5 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 四妙丸中藥化合物-共同靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖包含88個節(jié)點，235個相互作用關(guān)系。見圖6。根據(jù)自由度高低可得出較為重要的化合物、靶點及通路。見表2。

3 討論

四妙丸有清熱利濕的藥理作用和治療功效，能夠有效治療濕熱痹阻證骨關(guān)節(jié)炎。根據(jù)現(xiàn)代基礎(chǔ)研究表明，蒼術(shù)具有抗炎、抗過敏等作用[17]，黃柏具有調(diào)節(jié)機體自身免疫、抗炎、抗細胞凋亡等作用[18-19]，牛膝具有抗炎、擴張下肢血管、抗骨質(zhì)疏松等作用[20]，薏苡仁具有抗凝血、抗炎等作用[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)在中藥-主要成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中槲皮素（Quercetin）、漢黃芩素（Wogonin）、山柰酚（Kaempferol）、巴馬?。≒almatine）、黃連堿（Coptisine）、黃芩素（Baicalein）等的自由度最高。其中槲皮素不僅對關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)具有優(yōu)先的親和力，還表明它可以通過抑制和減少活性氧種類（ROS）和下游因子（如MMP）來有效保護關(guān)節(jié)軟骨。由于槲皮素本身是一種很強的抗氧化劑，它可以有效地通過抑制ROS的產(chǎn)生和NOX4的表達來提供潛在的軟骨保護作用[22]。另外還有一些研究結(jié)果表明槲皮素具有與塞來昔布相當?shù)目寡趸饔?，可增加SOD的含量，下調(diào)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）的表達并可以通過上調(diào)軟骨細胞中TIMP-1的基因表達，減弱機體對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，減輕關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)降解，從而有效改善骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)[23]。另外還有一些研究結(jié)果指出漢黃芩素有效地抑制了兔關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)細胞中潛在的IL-1β誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）、MMP-13和adamts-4的基因表達。同時它還恢復(fù)了IL-1β抑制的Ⅱ型膠原的基因表達。因此通過調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨破壞過程中不同蛋白酶的基因表達，以及在轉(zhuǎn)錄水平上促進II型膠原的基因轉(zhuǎn)錄表達，可有效支持漢黃芩素對軟骨的保護作用[24]。漢黃芩素可通過插入機制較好地表現(xiàn)出與軟骨細胞的DNA結(jié)合能力，其在細胞核內(nèi)可以通過抑制IL-1β介導(dǎo)的ROS誘導(dǎo)、DNA的碎片化、外源性和內(nèi)在性誘導(dǎo)的凋亡途徑，體現(xiàn)出對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的保護作用[25]。研究表明，山柰酚能顯著地抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶2的白細胞介素（IL）1β誘導(dǎo)蛋白表達。并且山柰酚還抑制了由IL-1β誘導(dǎo)的常見基質(zhì)降解酶，從而消除了膠原II的降解。山柰酚的抗炎作用是通過抑制絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和p38信號通路來介導(dǎo)的[26]。山柰酚的可以顯著地阻止脂多糖引發(fā)的軟骨細胞凋亡和炎性反應(yīng)，其能顯著下調(diào)MIR-146a，抑制了去整合素的表達，從而充分發(fā)揮對軟骨的保護作用[27]。有研究已經(jīng)證實了巴馬汀對IL-1β刺激誘導(dǎo)的兔軟骨細胞炎性反應(yīng)具有保護作用，其對MMP的抑制作用可能與Wnt/β-連環(huán)蛋白和Hedgehog信號通路的抑制有關(guān)[28]。研究表明，黃連素通過抑制NF-kB信號通路從而抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，其能顯著抑制一氧化氮和前列腺素E2的產(chǎn)生，抑制IL-1β誘導(dǎo)的人OA軟骨細胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶2的表達。同時也顯著地抑制了MMP-3和MMP-13在IL-1β刺激的人OA軟骨細胞中的表達，并且顯著抑制了人OA軟骨細胞中IL-1β誘導(dǎo)的NF-kB活化[29]。黃芩素的抗軟骨細胞凋亡作用主要是由于抑制一氧化氮的產(chǎn)生和阻斷Caspase下游的信號通路，其作用能顯著地降低關(guān)節(jié)軟骨細胞中MMP-3和MMP-13的分泌。黃芩素對小鼠關(guān)節(jié)軟骨外植體的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原沉積的恢復(fù)進一步證實了其抗分解代謝的重要作用[30]。故四妙丸治療骨關(guān)節(jié)炎的過程中較為重要的成分可能是槲皮素（Quercetin）、漢黃芩素（Wogonin）、山柰酚（Kaempferol）、巴馬?。≒almatine）、黃連堿（Coptisine）、黃芩素（Baicalein）等。

在中藥-化合物-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中自由度最高的前6位靶點為前列腺素G/H合成酶2（PTGS2），絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1），絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14），絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），腫瘤壞死因子（TNF），雄激素受體（AR）等。PTGS2是炎性反應(yīng)性PG生物蛋白合成的一個重要關(guān)鍵酶，其可以作為炎性反應(yīng)生物蛋白的標志物[31]。PTGS2在OA軟骨和滑膜組織中過度的表達，損害蛋白聚糖的合成并增強了軟骨中對軟骨聚集蛋白聚糖和II型膠原的降解[32]。有更多的研究結(jié)果表明，阿片類藥物誘導(dǎo)的對OA抗炎作用可能是由它們對MPGES和PTGS2表達的影響介導(dǎo)的[33]。TNF-α可與PGRN相互作用，誘導(dǎo)對軟骨細胞降解蛋白酶的表達和軟骨的丟失[34]。TNF-α可以通過激活NF-κB信號通路，上調(diào)各種MMP和ADAMT的水平，從而參與介導(dǎo)OA軟骨的降解[35]。研究結(jié)果表明，TNF/TNFR的配體寡聚誘導(dǎo)了銜接蛋白的募集，如Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白和Tradd，這些銜接蛋白通過同源死亡結(jié)構(gòu)域相互作用與受體胞質(zhì)尾部結(jié)合，Procaspase-8通過同源死亡效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域相互作用被銜接蛋白招募到復(fù)合物中，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，啟動半胱天冬酶進而激活細胞并執(zhí)行半胱天冬酶，其進而切割受體死亡底物，最終可能導(dǎo)致受體細胞凋亡[36]，細胞凋亡被認為是導(dǎo)致OA軟骨老化的一個關(guān)鍵因素[37]。睪酮的缺乏可誘導(dǎo)去勢家兔細胞凋亡，減少軟骨細胞的增殖和數(shù)量[38]。MA對雄性小鼠進行了體內(nèi)研究（睪丸切除術(shù)與對照組），并確定完整小鼠表現(xiàn)出更嚴重的OA。此外，去勢雄性小鼠補充了二氫睪酮后，與正常小鼠比較，出現(xiàn)了嚴重的OA[39]。MAPK1、MAPK14、MAPK8卻少見相關(guān)報道。故四妙丸治療骨關(guān)節(jié)炎的作用可能主要是通過調(diào)節(jié)PTGS2、TNF、AR等靶點來實現(xiàn)。

根據(jù)富集分析結(jié)果，四妙丸治療骨關(guān)節(jié)炎主要涉及的通路可能是IL-17信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、松弛素信號通路、TNF信號通路、破骨細胞分化等。IL-17主要影響關(guān)節(jié)中的軟骨細胞和成纖維細胞樣滑膜細胞（FLS），其細胞表面表達IL-17受體[40]。IL-17已被證明能有效抑制關(guān)節(jié)中的軟骨細胞合成蛋白聚糖，并且能促進軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生[41-43]。此外，IL-17影響其他對軟骨有一定負面影響的細胞因子和化合物的分泌，如IL-1、TNF、IL-6、NO和PGE2[44-46]。患者的血清和滑液中IL-17水平明顯升高，與OA病變的影像學和臨床表現(xiàn)表現(xiàn)呈正相關(guān)[47]。TNF-α是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變的關(guān)鍵炎性反應(yīng)因子之一，參與關(guān)節(jié)滑膜炎癥的反應(yīng)、軟骨細胞凋亡的啟動、軟骨損傷和修復(fù)之間的不平衡以及最終加速關(guān)節(jié)軟骨退化[48]。松弛素已被證明能在各種情況下引起抗炎作用。在大鼠和豚鼠的炎性反應(yīng)模型中，松弛素通過一氧化氮的產(chǎn)生介導(dǎo)抑制肥大細胞釋放組胺[49]。松弛素還抑制中性粒細胞[50]和肥大細胞[51]等炎性反應(yīng)細胞流入受損器官。研究結(jié)果表明，CD14-細胞促進破骨細胞的形成不僅發(fā)生在RA中，而且也發(fā)生在OA中，一種罕見的侵蝕性炎癥性O(shè)A可發(fā)生在手指間關(guān)節(jié)[52]。而流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化，糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路相關(guān)報道較少。此外研究發(fā)現(xiàn)四妙丸治療OA主要涉及蛋白質(zhì)去乙酰化的調(diào)控，細胞遷移參與新生血管生成，急性炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)，一氧化氮代謝過程，血管平滑肌細胞增殖，膠原分解過程等生物過程。由此可推測，四妙丸可能通過抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能來治療骨關(guān)節(jié)炎。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學挖掘到四妙丸中64種化合物及163個靶點，骨關(guān)節(jié)炎疾病靶點989個，其中四妙丸-骨關(guān)節(jié)炎疾病共同靶點18個，對共同靶點進行GO功能注釋及KEGG信號通路富集分析，得出四妙丸可能是通過調(diào)節(jié)PTGS2、TNF、AR等靶點，調(diào)控IL-17信號通路、TNF信號通路、松弛素、破骨細胞分化等通路，從而抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)機體免疫功能來治療骨關(guān)節(jié)炎。由于各種平臺數(shù)據(jù)庫、相關(guān)軟件算法的限制，本研究的預(yù)測結(jié)果可為四妙丸的基礎(chǔ)研究提供線索，為了提高結(jié)果的可靠性，其具體作用機制還需進一步的實驗來驗證。

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（2019-12-04收稿 責任編輯：蒼寧）