倪娜，楊艷，張琴，冷天艷，楊麗華

650101 昆明，昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 婦科

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，近半個世紀以來，卵巢癌全世界范圍發(fā)病率上升近2～3倍[1]，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率中排名第二，而死亡率卻位居婦科腫瘤之首[2]。漿液性卵巢癌是最常見的病理類型，發(fā)病隱匿,惡性程度高且預后差[3]。盡管近年來診療技術不斷改進，但該病仍缺乏有效的篩查手段及早期診斷指標和策略，約70%的患者在初診時已為晚期卵巢癌，標準的細胞減滅術聯(lián)合輔助性化療的治療方案亦很難達到治愈效果，并且超過70%的晚期患者因化療耐藥在2年內復發(fā)，5年生存率仍徘徊在30%，嚴重威脅著人類健康[4]。因此，探索卵巢癌發(fā)病機制，尋找與卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關的關鍵分子，對于漿液性卵巢癌的診治具有重要的臨床意義。近些年研究顯示脂代謝與多項惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。乙酰輔酶A?；D移酶2(acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2,ACAA2)是脂肪酸氧化步驟中的關鍵酶之一，可通過催化脂肪酸β-氧化，參與脂肪酸降解及延伸，是脂代謝過程中一個重要調控因子。Guo等[5]研究報道,直腸癌患者中ACAA2表達高者預后更好。近年來，白屈菜的藥理作用越來越多的受到國內外學者的關注，對白屈菜中抗癌活性成分開展了一系列研究，其主要的有效成分為異喹啉生物堿以及一些非生物堿類成分，具有抗癌作用的活性成分為白屈菜生物堿類化合物，包括血根堿、白屈菜紅堿、白屈菜堿等[6]。多項研究表明血根堿有抑制腫瘤生長的作用：Ma等[7]報道血根堿作用于Shh-Gli-Nanog pathway通路，抑制胰腺癌干細胞的增殖；Wei等[8]報道血根堿通過上調Fas相關因子1抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。因此，從中草醫(yī)藥資源中挖掘新型抗腫瘤藥物，有望成為漿液性卵巢癌中草藥抗腫瘤藥物的重要靶點。本研究基于公共數(shù)據庫中腫瘤信息，探討ACAA2在漿液性卵巢癌中的表達及其預后關系，并分析血根堿對ACAA2基因表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據庫(https://www.oncomine.org/)收集提取數(shù)據

根據如下篩選條件在數(shù)據庫中進行設定，用來篩選和提取所需的數(shù)據信息，設定具體篩選條件如下：1) Gene:ACAA2；2)Analysis Type: Differential Analysis，CancervsCancer Analysis，CancervsNormal Analysis; 3)Cancer Type: Ovarian Cancer；4)Sample Type: Clinical Specimen; 5)Data Type: mRNA；6)臨界值設定條件(P<0.05, fold change>2, gene rank=top 10%)。設定研究結果采用箱狀圖展示。

1.2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據庫(http://kmplot.com/analysis/)分析患者生存周期

篩選條件如下：①“Cancer: Ovarian Cancer”；②“Gene:ACAA2”；③“Survival: OS”。

1.3 主要試劑及儀器

本課題實驗中所應用的人漿液性卵巢癌細胞株SKOV3，購自中科院昆明動物研究所；血根堿(批號:20150607，純度>98%，分子式:C20H14NO4)，購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；Affymetrix人全基因單通道表達譜芯片，購自上海吉凱基因化學技術有限公司；超凈工作臺，SPEG AIR TECH，購自蘇州凈化設備廠；倒置相差熒光顯微鏡，DMIL LED，購自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿易有限公司；冷凍離心機，D-37520，購自賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)；恒溫振蕩器，TS-211B，購自上海天呈實驗器材制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，SI6R-2，購自美國Shellab公司。

1.4 人漿液性卵巢癌細胞株SKOV3培養(yǎng)

使用含10%標準胎牛血清和雙抗的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，置于恒溫培養(yǎng)箱中(設定培養(yǎng)條件：溫度37.0 ℃、濃度5%CO2、濕度95%)。細胞長滿培養(yǎng)瓶底面積八九成(貼壁率80%～90%)，經過胰酶消化、傳代、收集、離心，篩選對數(shù)生長期細胞凍存。

1.5 應用基因芯片檢測血根堿引起的差異表達基因

取對數(shù)生長期的漿液性卵巢癌SKOV3細胞，將細胞密度調整為1×105/mL，每孔500 μL，分別接種于12孔培養(yǎng)板中，劃分血根堿組及對照實驗組，每組3個復孔。6小時后于血根堿組加入含2.0 μmol/L血根堿培養(yǎng)液，對照組中則加生理鹽水； 48小時后應用TRIzol法提取細胞樣品中總RNA。使用Nanodrop ND-1000 UV進行質檢；根據RNeasy MiNi Protocol，使用QLAG-ENR Neasy?Kit提取純化總RNA。應用Affymetrix人全基因單通道表達譜芯片，由上海吉凱生物技術有限公司進行實驗檢測，進行歸一化整理，歸一化實驗數(shù)據并行差異表達基因分析，以上調及下調2倍作為差異基因標準(|logFC|≥2，F(xiàn)DR<0.05，P<0.05)。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 ACAA2基因在人卵巢癌組織中的表達

自Oncomine數(shù)據庫提取數(shù)據顯示，自2004年開始，共有9項研究涉及ACAA2基因在漿液性卵巢癌組織和正常組織中的表達，共有1 569個樣本，文章分別發(fā)表于Br J Cancer、Cancer Res、Clin Cancer Res、Cancer Sci，并有1 168個來自TCGA數(shù)據庫(美國癌癥與腫瘤基因組圖譜)的樣本。在Oncomine數(shù)據庫中對這9項研究結果進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，ACAA2基因在卵巢癌組織中表達顯著降低(P=0.028) (圖1)。

圖1ACAA2在Oncomine數(shù)據庫中卵巢癌中的表達

Figure 1.ACAA2Gene Expression in Ovarian Cancer in Studies Identified in Oncomine

2.2 不同數(shù)據集中ACAA2基因在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達

Oncomine數(shù)據庫中有9項關于ACAA2基因卵巢腫瘤中表達水平的研究在Bonome等[9]、Hendrix等[10]、Lu等[11]、Yoshihara等[12]及TCGA數(shù)據集5項涉及漿液性卵巢癌的研究中，ACAA2在漿液性卵巢癌中的表達量均顯著低于正常卵巢組織(P均<0.05)(圖2)。

圖2 Oncomine數(shù)據庫中ACAA2在不同卵巢癌研究芯片中的表達(P<0.05)

Figure 2.ACAA2Gene Expression in Different Ovarian Cancer Studies from Oncomine (P<0.05)

2.3 ACAA2水平與卵巢癌病患預后的關系

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據庫分析結果顯示：ACAA2表達高的卵巢癌患者總生存率高于表達低者(P<0.05)(圖3)。

圖3ACAA2水平與卵巢癌患者總體生存率之間的關系

Figure 3. Relationship betweenACAA2Levels and Overall Survival of Ovarian Cancer Patients

2.4 血根堿對卵巢癌細胞ACAA2基因表達豐度的影響

基因芯片檢測血根堿作用于卵巢癌SKOV3細胞后的基因表達譜，ACAA2為其中一個差異表達基因，血根堿處理后ACAA2水平顯著增高(P<0.001，F(xiàn)DR=9.22×10-7，|logFC|=3.15)(圖4)。

圖4 血根堿對卵巢癌SKOV3細胞ACAA2基因表達的影響(注：與對照組比較，***P<0.001)

Figure 4. Effect of Sanguinarine onACAA2Gene Expression in SKOV3 Ovarian Carcinoma Cells (Sanguinarine GroupvsControl Group,***P<0.001)

3 討 論

近年來，越來越多研究證實，脂質代謝與膠質母細胞瘤[13]、乳腺癌[14]、肺癌[15]、直腸癌[16]及胃癌[17]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，脂肪生成增加幾乎是所有癌細胞的共性，大部分產生的脂肪都在細胞增殖中用于細胞膜的構建[18-19]。Kim等[20]提出卵巢癌惡性腹水中膽固醇升高，其機制是通過上調膽固醇受體LXR ɑ/β及藥物外排泵蛋白(ABCG2、MDR1)的表達來增加對PAC化療方案(包括順鉑DDP、阿霉素ADM及環(huán)磷酰胺CTX)的敏感性。Schafer等[21]首次證明了脂肪酸氧化對腫瘤細胞代謝應激狀態(tài)下的生存起著至關重要的作用。參與脂肪酸合成過程中的關鍵酶，如三磷酸腺苷-檸檬酸裂解酶、脂肪酸合酶以及乙酰輔酶A羧化酶在多種惡性腫瘤中表達活性增加[22]，并且Qiu等[23]的研究表明膳食脂肪攝入及脂肪酸膳食與卵巢癌發(fā)生密切相關。

ACAA2是脂肪酸β-氧化途徑中的關鍵酶，參與體外脂肪細胞分化。ACAA2分布在線粒體中，脂肪酸在進行β-氧化時產生的乙酰輔酶A，在ACAA2作用下催化縮合進入三羧酸循環(huán)氧化釋放維持細胞活性所需的能量，參與脂肪酸代謝、調節(jié)線粒體細胞信號轉導、細胞凋亡信號等，為參與脂類代謝的關鍵基因。多位學者研究認為，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)通過ACAA2等關鍵基因作用于細胞脂肪酸攝取、線粒體脂肪酸氧化等途徑參與脂質代謝，并提出ACAA2可能通過PPAR信號通路參與脂代謝[24-25]。本研究通過挖掘并分析Oncomine數(shù)據庫中收錄的卵巢癌基因表達譜數(shù)據，發(fā)現(xiàn)ACAA2基因在漿液性卵巢癌組織中的表達明顯低于正常卵巢組織。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據庫分析生存數(shù)據發(fā)現(xiàn)，高表達患者的預后更好，推測ACAA2基因在漿液性卵巢癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用，并主要通過脂肪酸β-氧化途徑參與脂肪細胞的分化而發(fā)揮作用的。

中草藥提取物的抗癌作用歷史悠久，如紫杉醇、長春新堿和喜樹堿等已廣泛用于惡性腫瘤的治療[26]。近年來篩選以天然成為為主的有效且毒副作用小的中草藥抗癌藥物,并對具有抗癌活性的有效成分進行深入研究已成為抗腫瘤藥物開發(fā)領域的熱點之一。白屈菜ChelidoniummajusL，最早記載于《救荒本草》用作鎮(zhèn)痛藥，也有記載白屈菜用于胃癌、皮膚癌、肺結核以及皮膚膿瘡和蟲蛇咬傷等的治療[27]。目前白屈菜仍廣泛用與我國的多種方劑中，如天蟾膠囊、理肺止咳膠囊方、輔助肺癌化療的中藥制劑方[28]。烏克蘭應用白屈菜提取白屈菜生物堿硫代磷酸復合物UKRAIN進行胰腺癌的治療,取得良好療效[29]。血根堿為白屈菜主要成分之一，多項研究均證實血根堿可抑制胰腺癌及非小細胞肺癌[7-8]。本課題組在前期研究中也證實，血根堿可以抑制卵巢癌、耐藥卵巢癌細胞增殖及轉移，并有誘導卵巢癌細胞凋亡的作用[30-31]。為探討ACAA2在卵巢癌治療中的靶點作用，我們團隊通過人全基因組表達譜芯片檢測了血根堿作用于卵巢癌細胞株后的基因表達改變?；蛐酒瑱z測共獲1 185個差異基因，ACAA2為其中之一，并且血根堿可顯著上調ACAA2基因表達豐度，這提示ACAA2可能為血根堿的一個靶基因，血根堿通過上調ACAA2而表達發(fā)揮抑制卵巢癌細胞增殖的作用。

綜上所述，通過Oncomine數(shù)據庫及Kaplan-Meier Plotter數(shù)據庫生存分析軟件進行卵巢癌中ACAA2相關信息的挖掘，我們發(fā)現(xiàn)ACAA2基因在漿液性卵巢癌組織中表達降低，且其表達水平與卵巢癌預后呈正相關。細胞學試驗初步證實，血根堿可能通過上調其表達抑制卵巢癌細胞增殖，但后期仍需進一步體外實驗驗證，同時深入探討其作用機理，為卵巢癌的診治提供新視角。

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