趙宗霞，蘇玉強(qiáng)，曾娟，雙婷，陳必良

710038 西安，西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科(趙宗霞、曾娟),麻醉科(蘇玉強(qiáng))； 710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 婦產(chǎn)科(趙宗霞、陳必良)；710000 西安，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科(雙婷)

卵巢癌是一種嚴(yán)重威脅全球婦女健康的惡性腫瘤。雖然其發(fā)病率低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但其死亡率在女性婦科腫瘤中最高[1]。卵巢癌在發(fā)病早期缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致大部分患者在診斷時就已處晚期并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后極差[2]。研究表明，卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素影響的復(fù)雜病理過程，其中卵巢癌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移性和侵襲性導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]，而腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)在卵巢惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[4]。TME是指由環(huán)繞在腫瘤組織周圍的腫瘤細(xì)胞及相關(guān)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞及炎癥相關(guān)因子等組成的生物環(huán)境[5]。卵巢癌具體的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，研究顯示肝癌、結(jié)腸癌和胃癌等腫瘤組織中，腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast,CAF)可以分泌細(xì)胞基質(zhì)衍生因子、骨橋蛋白和肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)等細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。HGF是一種可以促進(jìn)肝細(xì)胞生長的細(xì)胞因子，有文獻(xiàn)報道其在多種腫瘤組織中都異常高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]，但是HGF在卵巢癌中的表達(dá)及與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確。因此，本研究采用卵巢癌患者腫瘤組織、癌旁組織和正常卵巢組織及卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞，探討腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的HGF與卵巢癌細(xì)胞增殖是否相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

本次研究共納入本院婦產(chǎn)科2017年5月至2018年10月收治的49例卵巢癌患者及需婦科手術(shù)治療的非卵巢癌患者40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)所有卵巢癌患者的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)檢查結(jié)果均符合卵巢癌的診斷(依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版)；2)卵巢癌患者均于我院首診，且術(shù)前未經(jīng)任何放化療；3)病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)依從性差；2)其他系統(tǒng)合并癥；3)有絕對手術(shù)禁忌證。49例卵巢癌患者的年齡為32～69歲，平均年齡(41.82±7.35)歲。40例非卵巢癌患者年齡為31～71歲，平均年齡(45.28±5.91)歲。

1.2 材料

卵巢癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(human endometrial carcinoma-1A cell,HEC-1A)、卵巢癌細(xì)胞SKOV3均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞典藏庫；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、聚丙烯酸胺凝膠、結(jié)晶紫固體粉末購自廣州科維生物技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶及胎牛血清購自美國Hyclone公司；雙抗及4%多聚甲醛購自西安科昊有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 本研究中收集的卵巢癌組織49例、癌旁組織(距腫瘤≥1 cm的正常卵巢組織)49例以及正常組織40例進(jìn)行石蠟包埋切塊。隨后進(jìn)行脫蠟和水化處理，抗原修復(fù)后滴加封閉液；1∶500稀釋HGF一抗孵育；孵育結(jié)束后用PBS進(jìn)行沖洗，加生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；PBS再次沖洗，滴加親和素-過氧化酶溶液孵育。次日二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，蘇木素染液復(fù)染，中性樹膠固封；PBS作為一抗陰性對照組,結(jié)果判斷采用半定量分析[7]。

1.3.2 CCK-8增殖實(shí)驗 體外增殖實(shí)驗分對照組和實(shí)驗組；對照組：用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整SKOV3細(xì)胞濃度為5×104/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入96孔板；實(shí)驗組，收集HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)48小時后的培養(yǎng)上清2 mL重懸SKOV3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入96孔板，每組6復(fù)孔，培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)12 h、36 h和48 h后加入CCK-8溶液10 μL，37°孵育1～4小時后在酶聯(lián)免疫儀上選擇450 nm波長測定吸光度值，計算每組濃度復(fù)孔的平均值。

1.3.3 平板克隆形成實(shí)驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，常規(guī)消化離心收集細(xì)胞沉淀，重懸細(xì)胞沉淀，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整SKOV3細(xì)胞濃度為1×103/mL，取150 μL細(xì)胞懸液(即150個細(xì)胞)接種至培養(yǎng)皿，補(bǔ)加培養(yǎng)基至10 mL，作為對照組。實(shí)驗組收集HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)48小時后的培養(yǎng)上清2 mL，重懸SKOV3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×103/mL，取150 μL細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)皿，補(bǔ)加HEC-1A培養(yǎng)上清至10 mL，在37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15天，棄培養(yǎng)液，加入5 mL PBS洗劑2次，棄PBS，4%多聚甲醛固定15 min，棄固定液，0.1% 結(jié)晶紫染色20 min， 自來水沖洗，空氣干燥，計算肉眼可見的克隆數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫熒光 取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，胰蛋白酶消化，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，每孔2 mL細(xì)胞混懸液，直接接種至6孔板，作為對照組。實(shí)驗組HEC-1A細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞按1∶1的比例接種于Transwell小室上室，在37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞形態(tài)變化，并進(jìn)一步通過免疫熒光檢測兩組上皮細(xì)胞標(biāo)志物上皮-鈣粘素的表達(dá)。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，胰蛋白酶消化，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，每孔2 mL細(xì)胞混懸液，直接接種至6孔板，作為對照組。實(shí)驗組HEC-1A細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞按1∶1的比例接種于Transwell上室，在 37℃、95%濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集兩組細(xì)胞培養(yǎng)液，低溫離心，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測培養(yǎng)液中HGF的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型膠原蛋白(Collagen I)在卵巢癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達(dá)情況

首先，免疫組織化學(xué)染色檢測CAF標(biāo)志蛋白α-SMA和Collagen I在卵巢癌患者3種不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示α-SMA和Collagen I在卵巢癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常組織 (***P<0.001)(圖1)。

圖1 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA和Collagen I在卵巢癌患者組織中的表達(dá)

Figure 1. Expression of α-SMA and Collagen I in Tissue of Patients with Ovarian Cancer

2.2 HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)上清促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞增殖

為了體外驗證腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是否對卵巢癌起到促癌作用，體外我們將卵巢癌相關(guān)成纖維細(xì)胞HEC-1A培養(yǎng)48小時后的培養(yǎng)上清孵育卵巢癌細(xì)胞SKOV3。結(jié)果表明用HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)上清處理后的SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)36 h和48 h后，增殖能力顯著增強(qiáng) (*P<0.05,**P<0.01)(圖2)。

圖2 HEC-1A培養(yǎng)上清對SKOV3 細(xì)胞增殖能力影響

Figure 2. Effect of HEC-1A Supernatant on the Proliferation of SKOV3 Cells

2.3 HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)上清促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞克隆形成能力

為了進(jìn)一步驗證腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對卵巢癌的促癌作用。我們用克隆形成實(shí)驗檢測了HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞后克隆形成能力的變化。結(jié)果顯示HEC-1A培養(yǎng)上清培養(yǎng)后，SKOV3 細(xì)胞克隆形成能力明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(***P<0.001)(圖3)。腫瘤成纖維細(xì)胞可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖作用。

圖3 HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)上清對SKOV3 細(xì)胞克隆形成能力影響

Figure 3. Effect of HEC-1A Supernatant on Clone Formation Ability of SKOV3 Cells

2.4 HEC-1A細(xì)胞共培養(yǎng)后促進(jìn)SKOV3上皮樣細(xì)胞增多

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的相關(guān)因子，對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)具有一定的誘導(dǎo)作用，具體表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞上皮樣細(xì)胞增多，從而導(dǎo)致其增殖和遷移能力增強(qiáng)。為了觀察腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞形態(tài)變化的影響，將SKOV3細(xì)胞與HEC-1A細(xì)胞共培養(yǎng)后，在倒置顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后卵巢癌SKOV3細(xì)胞呈上皮樣細(xì)胞形態(tài)明顯增多，并聚集成簇(圖4)。并進(jìn)一步通過免疫熒光檢測了兩組上皮細(xì)胞標(biāo)志物上皮-鈣粘素的表達(dá)，結(jié)果顯示HEC-1A培養(yǎng)上清處理組細(xì)胞的表達(dá)明顯高于未處理組 (P<0.01)(圖5)，這說明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可以激活卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

圖4 HEC-1A細(xì)胞共培養(yǎng)對SKOV3 細(xì)胞形態(tài)變化影響

Figure 4. Effect of HEC-1A Co-Cultured with SKOV3 on Morphological Changes of SKOV3 Cells

圖5 E-cadherin在HEC-1A培養(yǎng)上清處理組和未處理組SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 5. Expression of E-cadherin in HEC-1A Supernatant Treated and Untreated SKOV3 Cells

2.5 HEC-1A細(xì)胞共培養(yǎng)后SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)液HGF表達(dá)明顯增高

為了研究腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞是否通過分泌HGF來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力，ELISA檢測了共培養(yǎng)前后SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)液HGF的表達(dá)情況。結(jié)果顯示共培養(yǎng)后SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)液HGF表達(dá)明顯高于對照組SKOV3 細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖6)。說明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可能通過分泌HGF促進(jìn)了卵巢癌的增殖作用。

圖6 Elisa檢測HEC-1A細(xì)胞共培養(yǎng)后SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)液中HGF表達(dá)變化

Figure 6. Changes of HGF Expression in the Supernatant of HEC-1A Co-Cultured with SKOV3 Detected by Enzyme Linked Immunosorbent Assay

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居婦科腫瘤相關(guān)死亡第一位。卵巢癌早期由于缺乏特異性的臨床表現(xiàn)和診斷方法，導(dǎo)致診斷時已處于晚期并合并其他臟器的轉(zhuǎn)移，5年生存率約40%，復(fù)發(fā)率約80%，預(yù)后差[8-9]。癌轉(zhuǎn)移是死亡的重要原因，高復(fù)發(fā)率和高耐藥率是導(dǎo)致該疾病高死亡率的最重要原因。因此，探究卵巢癌發(fā)生機(jī)制及如何改善早期卵巢癌檢測的篩查方法就顯得尤為重要。

盡管對癌細(xì)胞進(jìn)行了廣泛的研究，但目前研究表明癌癥的進(jìn)展主要取決于個體的生物學(xué)行為，這些行為是通過癌細(xì)胞與TME之間的相互作用來調(diào)節(jié)的[10]。 大量研究表明，TME在不同腫瘤進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用[11-13]。TME本質(zhì)上是異質(zhì)性的，包含周圍的細(xì)胞外基質(zhì)和幾種不同類型的細(xì)胞，包括CAF、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、局部和骨髓來源的基質(zhì)干細(xì)胞和祖細(xì)胞[14]。幾種因素介導(dǎo)CAF的分化，某些標(biāo)記物包括α-SMA、成纖維細(xì)胞活化蛋白和血小板衍生生長因子受體α/β，已被用于區(qū)分CAF和其他類型的成纖維細(xì)胞[15-17]。

有研究報道腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可以分泌骨橋蛋白和肝細(xì)胞生長因子從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。同時有文獻(xiàn)報道在結(jié)腸癌組織中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的肝細(xì)胞生長因子能夠刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞衍生為腫瘤干細(xì)胞，導(dǎo)致其促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力[19]。HGF是一種生理狀態(tài)下由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的具有多功能的細(xì)胞生長因子，與其特異性受體酪氨酸蛋白激酶Met結(jié)合后可以發(fā)揮多種生物學(xué)功能，例如：促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)腫瘤組織血管和淋巴管的生成等[20]。

本研究首先通過檢測腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA和Collagen I在卵巢癌組織、癌旁組織及正常卵巢組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織和正常卵巢組織，表明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。隨后通過體外CCK-8實(shí)驗和克隆形成實(shí)驗顯示腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞的增殖能力。此外，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)液中HGF的表達(dá)明顯增高，進(jìn)一步說明卵巢癌相關(guān)成纖維細(xì)胞可能通過分泌HGF促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。

綜上所述，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可能通過分泌HGF促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖能力，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。而卵巢癌患者體內(nèi)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞來源何處，HGF是否還有下游調(diào)控因子來調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展均有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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