李 穎 矯 健 張 羅*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730; 2. 北京市耳鼻咽喉科研究所 耳鼻咽喉頭頸科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(首都醫(yī)科大學(xué))，鼻病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

鼻息肉是多種致病因素作用下鼻黏膜的慢性持續(xù)性炎性反應(yīng)。近年來(lái)，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入。體外培養(yǎng)細(xì)胞免疫熒光染色作為基本技術(shù)手段普遍應(yīng)用于研究中，對(duì)于不同的標(biāo)記蛋白，固定劑的選擇對(duì)染色結(jié)果起著至關(guān)重要的作用。為探討不同固定劑對(duì)不同標(biāo)記蛋白免疫熒光染色結(jié)果的影響，筆者選擇了3種細(xì)胞染色中常用的固定劑及4種研究中用到的不同結(jié)合部位的標(biāo)記蛋白，應(yīng)用于此研究中。為在鼻息肉發(fā)病機(jī)制的研究中，細(xì)胞免疫熒光染色最佳固定劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織細(xì)胞培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取鼻息肉組織, 浸泡于含有雙抗的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中, 浸泡并沖洗3 遍,置于0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)中，4 ℃過夜后5%(體積分?jǐn)?shù)) FBS終止消化，離心收集上皮細(xì)胞，以2.5×105/mL密度接種于四孔培養(yǎng)板中蓋玻片上，加入培養(yǎng)液，37 ℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。第七天終止培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器

兔多克隆抗緊密連接蛋白(zonular occludens-1，ZO-1)抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；鼠單克隆抗β-微管蛋白(tubulin)抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔多克隆抗跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)抗體, 兔多克隆抗組蛋白去乙?；?(histone deacetylases1,HDAC1)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司； 羅丹明標(biāo)記羊抗鼠IgG，羅丹明標(biāo)記羊抗兔 IgG購(gòu)自美國(guó)Merck公司；含DAPI熒光封片劑購(gòu)自美國(guó)abcam公司等。IX81激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為1、2、3、4四組，每組為6個(gè)細(xì)胞爬片，棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，每組分別用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)、等體積甲醇丙酮及甲醇3種固定劑固定(每種固定劑固定兩張細(xì)胞爬片)，室溫固定10 min，分別用PBS洗3遍，1%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100透膜10 min，PBS洗3遍，封閉用山羊血清封閉非特異性染色20 min，第1組滴加一抗ZO-1 1∶100、第2組滴加一抗β-tubulin 1∶500、 第3組滴加一抗TMEM16A 1∶100、 第4組滴加一抗HDAC1 1∶100，4 ℃孵育過夜，PBS洗3遍，分別滴加羅丹明標(biāo)記羊抗鼠IgG 1∶100，或羅丹明標(biāo)記羊抗兔IgG 1∶100相應(yīng)熒光二抗，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗3遍，含DAPI封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法

同一標(biāo)記蛋白在掃描參數(shù)相同的情況下，將圖像調(diào)至相對(duì)最清晰時(shí)進(jìn)行40倍掃描獲取圖像。結(jié)合圖像的熒光強(qiáng)度及抗體結(jié)合的特異程度，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

2.1 第1組(ZO-1組)染色結(jié)果

4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA固定的細(xì)胞ZO-1在細(xì)胞密集區(qū)的細(xì)胞緊密連接處呈陽(yáng)性表達(dá)，但染色不清晰，且有細(xì)胞質(zhì)非特異性背景染色。等體積甲醇丙酮混合液和甲醇固定的細(xì)胞ZO-1細(xì)胞密集區(qū)細(xì)胞緊密連接處呈陽(yáng)性表達(dá)，且染色清晰，幾乎無(wú)細(xì)胞質(zhì)非特異性背景染色(圖1)。

圖1 免疫熒光染色3種不同固定劑固定的ZO-1染色結(jié)果

2.2 第2組(β-tubulin組)染色結(jié)果

4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA、等體積甲醇丙酮混合液及甲醇固定的細(xì)胞β-tubulin骨架蛋白染色均層次清晰，微絲結(jié)構(gòu)完整，立體感較強(qiáng)，無(wú)非特異性背景染色，尤以甲醇固定的結(jié)果更為突出(圖2)。

2.3 第3組(TMEM16A組)染色結(jié)果

4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA固定的細(xì)胞TMEM16A幾乎無(wú)特異性染色。等體積甲醇丙酮混合液及甲醇固定的細(xì)胞細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)蛋白陽(yáng)性表達(dá)清晰明顯，背景清晰(圖3)。

2.4 第4組(HDAC1組)染色結(jié)果

4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA、等體積甲醇丙酮混合液及甲醇固定的細(xì)胞HDAC1細(xì)胞核陽(yáng)性均染色較強(qiáng)，核質(zhì)清晰，無(wú)非特異性背景染色(圖4)。

圖2 免疫熒光染色3種不同固定劑固定的β-tubulin染色結(jié)果

圖3 免疫熒光染色3種不同固定劑固定的TMEM16A染色結(jié)果

圖4 免疫熒光染色3種不同固定劑固定的HDAC1染色結(jié)果

3 討論

免疫熒光染色中固定的目的是迅速終止酶的活性，避免組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的解體，將抗原穩(wěn)定固定在原位，并保持其抗原性。良好的固定劑應(yīng)能保持細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真實(shí)性，并使抗體大分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合[1]。一般生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的固定劑分為兩大類：有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑[2]。有機(jī)溶劑如丙酮及醇類等，其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對(duì)組織穿透性很強(qiáng)，保存抗原的免疫活性較好。交聯(lián)劑如PFA，其作用是使組織之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，其優(yōu)點(diǎn)是組織穿透性強(qiáng)，收縮性小[3]。在日常免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，不同的固定劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果起著至關(guān)重要的作用，有時(shí)還會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。為驗(yàn)證固定劑對(duì)免疫熒光染色結(jié)果的影響和為今后的實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，選用了細(xì)胞染色中較常用的4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA、等體積甲醇丙酮混合液及甲醇3種固定劑，應(yīng)用于本研究中。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性，筆者經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，將4種標(biāo)記蛋白的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定出除固定劑外的最佳實(shí)驗(yàn)條件，用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察3種固定劑對(duì)不同標(biāo)記蛋白的固定效果。

微管蛋白屬細(xì)胞骨架蛋白，是細(xì)胞骨架纖維中最粗的一種,分為3大類α-tubulin、β-tubulin 和γ-tubulin[4]。其中β-tubulin常被用于免疫染色觀察細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)[5]。微管不僅與細(xì)胞形態(tài)密切相關(guān), 而且參與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息傳遞以及細(xì)胞分裂、分化、基因表達(dá)等多種功能。因此β-tubulin 正常排列的破壞及表達(dá)異常與纖毛的功能異常、細(xì)胞損傷等密切相關(guān)。有機(jī)溶劑固定劑在去除脂質(zhì)使細(xì)胞脫水的同時(shí)，使蛋白質(zhì)瞬間沉淀在細(xì)胞骨架上。作為一種胞外的細(xì)胞骨架蛋白，3種固定劑均取得較好的固定效果，尤其是甲醇固定的β-tubulin染色極其清晰。

上皮的屏障功能依賴于上皮細(xì)胞的完整性和細(xì)胞間相連接的連接復(fù)合體，其中起決定性作用的是緊密連接[6]。緊密連接的屏障功能受不同外源性刺激的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，與人類健康和對(duì)疾病的易感性密切相關(guān)[7]。緊密連接功能失調(diào)、細(xì)胞間通透性增高，炎性反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)入，激發(fā)黏膜免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)和組織損傷。緊密連接位于細(xì)胞與細(xì)胞之間連接的最頂端，由緊密連接相關(guān)蛋白組成。ZO-1是最具特征的胞質(zhì)緊密連接蛋白[8]。4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA作為一種能較好保護(hù)抗原結(jié)構(gòu)的固定劑，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色中，但由于它的作用溫和可能會(huì)損失某些細(xì)胞成分的抗原性。雖然筆者在實(shí)驗(yàn)中增加了打孔透膜步驟，但ZO-1的染色結(jié)果還是不夠理想。而等體積甲醇丙酮混合液及甲醇的固定效果都很好，緊密連接染色清晰銳利。

TMEM16A屬于具有多次跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)家族——TMEM16 家族。2008年，3個(gè)獨(dú)立的研究小組分別從不同角度驗(yàn)證鈣激活氯離子通道 (calcium-activated chloridechannels，CaCCs)的1個(gè)分子身份為TMEM16A[9]。眾所周知， CaCCs 最重要的功能之一是在上皮細(xì)胞中為氯離子的分泌提供路徑。在許多上皮組織中，都觀察到TMEM16A的高表達(dá)，包括呼吸道上皮[10]、唾液腺[11]、胰腺導(dǎo)管細(xì)胞[12]和腸道上皮細(xì)胞[13]。因而，對(duì)于TMEM16A在上皮細(xì)胞液體分泌過程中作用的研究十分重要。TMEM16A表達(dá)于胞膜和胞質(zhì)中，除4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA固定細(xì)胞未見陽(yáng)性表達(dá)外，其余兩種固定劑固定的細(xì)胞均見較好的胞膜及胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)。

HDAC1是哺乳動(dòng)物的第一個(gè)組蛋白去乙酰化酶，在組蛋白乙?；降恼{(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[14]。HDAC1蛋白由482個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量為55 000, HDAC1蛋白能夠降低組蛋白的乙?；? 促使染色體形成一個(gè)超螺旋結(jié)構(gòu), 抑制機(jī)體內(nèi)正常基因的表達(dá), 促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng), 主要存在于細(xì)胞核內(nèi), 能夠調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。近年來(lái)也應(yīng)用于鼻息肉的研究中。作為一種胞核蛋白，3種固定劑均取得了較好的固定效果。

綜上所述，等體積甲醇丙酮混合液及甲醇在骨架蛋白、細(xì)胞連接蛋白、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白、胞核蛋白的染色中均取得較好的固定效果，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA對(duì)細(xì)胞連接蛋白和胞漿蛋白的固定效果不理想。一般來(lái)說，有機(jī)溶劑固定劑用于細(xì)胞骨架成分的固定，交聯(lián)劑固定劑用于膜相關(guān)成分的固定。但這并不是絕對(duì)的，本結(jié)果就與之不完全相同。因?yàn)椴煌乖?，其穩(wěn)定性也不相同，因而對(duì)固定劑的耐受性差異較大[3]。而且每一種固定劑都有它的長(zhǎng)處和短處，沒有一種固定劑適用于所有標(biāo)記蛋白，必要時(shí)，可作多種固定劑對(duì)比，從而選出理想的固定方法。根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，在細(xì)胞免疫熒光染色中要結(jié)合所要檢測(cè)抗原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和不同固定劑的特性，來(lái)對(duì)固定劑進(jìn)行選擇。其次，抗體生產(chǎn)廠家的選擇、打孔步驟的添加、細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)等等均對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著至關(guān)重要的影響。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)鼻息肉發(fā)病機(jī)制研究中用到的幾種標(biāo)記蛋白的固定劑選擇進(jìn)行了探究，以期為此項(xiàng)研究的細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)提供參考依據(jù)，奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。