王 敏 李 穎 王向東 張 羅

(首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 耳鼻咽喉頭頸科學教育部重點實驗室 鼻病研究北京市重點實驗室，北京 100005)

慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)按照是否合并鼻息肉(nasal polyps，NP)分為慢性鼻竇炎不合并鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)和慢性鼻竇炎合并鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)。CRSsNP主要是以Th1反應為主，在歐洲CRSwNP主要以Th2反應為主，在亞洲除了Th2反應，Th17反應也是主要參與通路之一[1-3]。

白細胞介素-23(interleukin-23,IL-23)屬于IL-12家族成員，為異二聚體，包括IL-23特異性的p19亞單位和與IL-12共享的p40亞單位。IL-23受體相應的也為異二聚體，由IL-12Rβ1和IL-23R兩個亞單位組成。IL-23R主要表達在T細胞、自然殺傷T細胞(natural killer T cell，NKT)、單核細胞和樹突細胞。IL-23在Th17細胞的分化中具有重要作用，但是IL-23并不能促使初始T細胞(naive T cell)體外向Th17細胞分化，因為naive T cell表面無IL-23R表達。Naive T cell首先在轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)、IL-6和IL-21的作用下形成承諾性Th17細胞，這種細胞表面有IL-23R的表達，隨后在IL-23的作用下分化成Th17細胞[4]。IL-23-Th17通路參與了多種疾病的發(fā)生，例如牛皮癬[5]、 關節(jié)炎[6]、炎性腸病[7]等。有研究[8]證實IL-23在CRSwNP表達增高，但其在NP中的作用機制尚不清楚。本研究主要探討了IL-23因子在CRSsNP和CRSwNP中的表達及與Th17反應的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

募集15例受試者(正常對照組)，14例CRSsNP患者(CRSsNP組)和37例CRSwNP患者(CRSwNP組)，取因解剖變異而進行鼻中隔成形術的正常對照組受試者的下鼻甲，CRSsNP組患者的篩竇黏膜和CRSwNP組患者的NP組織。依據(jù)臨床檢查、鼻內鏡和CT檢查結果確診CRSsNP和CRSwNP 病例[9]。本研究與前期研究的研究對象相同，研究對象的臨床特征詳見前期研究[10]。

1.2 組織勻漿的制備

組織勻漿的制備參考前期研究[10]。簡單處理過程為凍存的組織稱質量，自動勻漿機勻漿2 min，用含有1%(質量分數(shù))蛋白酶抑制劑的0.9%(質量分數(shù))氯化鈉注射液溶解，然后離心收集上清，-70 ℃保存，用于細胞因子IL-23、IL-17 和髓過氧化物酶(myelo-peroxidase, MPO)的檢測。

1.3 NP組織單個細胞懸液的制備和體外刺激

NP組織單個細胞懸液采用酶消化法制備，參考前期研究[11]。簡單的處理過程為將新鮮的NP組織用剪刀剪成小塊，然后移入Gentle MACs 管(Miltenyi Biotec公司, 德國)中，在Gentle MACs 儀器(Miltenyi Biotec公司，德國)上絞碎，離心收集絞碎的組織用2 mg/mL 膠原酶(Gibco Life Technologies公司, 英國)和0.04 mg/mL DNAse1(Roche Diagnostics公司, 德國)，37 ℃消化45 min，然后在Gentle MACs儀器上再次絞碎，離心收集細胞，70 μm 細胞篩(BD Falcon公司, 美國)過濾，裂解紅細胞后收集細胞。

將上述NP組織單個細胞用100 ng/mL的IL-23(R&D Systems公司，美國)刺激24 h，然后收集培養(yǎng)上清，后續(xù)檢測IL-17、IL-1β、IL-8和粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)濃度。

1.4 細胞因子檢測

采用Luminnex 法檢測鼻黏膜組織IL-23、IL-17 和MPO濃度(Magnetic Luminex Performance Assay, R&D Systems; 美國)；NP組織單個細胞培養(yǎng)上清IL-17、IL-1β、IL-8和G-CSF濃度(Bio-Rad公司, 美國)。

1.5 外周血中性粒細胞分析

外周血中性粒細胞數(shù)目和百分比采用標準的全自動細胞計數(shù)儀進行分析。

1.6 組織中性粒細胞計數(shù)

將鼻黏膜組織石蠟包埋后進行蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色，然后隨機選取10個高倍視野(400×)，計數(shù)中性粒細胞數(shù)目，表示為“平均中性粒細胞數(shù)目/高倍視野”。

1.7 統(tǒng)計學方法

結果用GraphPad Prism 5.0 軟件包(Graphpad Software, San Diego, CA, 美國)分析。數(shù)據(jù)以M(P25,P75)表示。組間比較用Mann-WhitneyU-test，刺激前后比較用Wilcoxon signed rank test。相關分析采用Spearman法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-23在慢性鼻竇炎中的表達

與正常對照組相比，IL-23的濃度在CRSsNP組未見增高；CRSwNP組作為一個整體有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(圖1A)。對照組15例中有0例IL-17陽性表達，14例CRSsNP組患者中只有4例IL-17陽性表達，而37例CRSwNP組患者中有23例IL-17陽性表達，因此，與正常對照組及CRSsNP組相比，CRSwNP組有明顯的IL-17亞群的存在。將CRSwNP組按照IL-17蛋白能否檢出進一步分為IL-17-CRSwNP和IL-17+CRSwNP兩個亞組，可以看出IL-23在IL-17+CRSwNP組的表達顯著高于IL-17-CRSwNP組及正常對照組(圖1B)。

圖1 IL-23在CRSsNP和CRSwNP(A)及IL-17-CRSwNP和IL-17+CRSwNP(B)患者鼻黏膜組織勻漿的濃度

2.2 IL-23與中性粒細胞相關指標的相關性

相關性分析顯示鼻黏膜組織IL-23濃度與MPO濃度呈正相關，但是與組織中性粒細胞的數(shù)目無相關性；與外周血中性粒細胞數(shù)目呈負相關，詳見表1。

表1 全部研究對象組織勻漿中IL-23濃度與中性粒細胞性指標的相關性

IL-23: interleukin-23;MPO: myelo-peroxidase.

2.3 IL-23細胞因子體外對NP組織中Th17因子生成的調節(jié)

IL-17、IL-1β、IL-8和G-CSF為Th17免疫通路的重要因子。IL-23體外刺激NP組織單個細胞懸液能夠顯著上調IL-17和IL-1β的生成，但對IL-8和G-CSF的表達沒有影響(圖2)。

3 討論

以往研究[8]報道,NP組織IL-23陽性細胞數(shù)、IL-23蛋白水平和IL-23p19mRNA水平顯著高于正常鼻黏膜組織[8]。與此結果相似，筆者發(fā)現(xiàn)CRSwNP患者的NP組織IL-23蛋白水平有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。盡管歐洲的CRSwNP患者主要以Th2反應為主，但是亞洲CRSwNP患者同時還存在Th17反應[1]。因此，按照NP組織IL-17能否檢出，筆者將CRSwNP患者進一步分為IL-17陽性和陰性兩個亞組，發(fā)現(xiàn)IL-17陽性CRSwNP組鼻黏膜組織IL-23蛋白水平顯著高于正常對照組和IL-17陰性CRSwNP組，提示IL-23可能參與了CRSwNP中的Th17反應。

圖2 IL-23刺激對NP組織單個細胞中Th17相關因子生成的調節(jié)

盡管以往研究[5-7]報道，IL-23-Th17通路參與了多種疾病的發(fā)生，但是CRSwNP中IL-23與Th17反應的關系尚未見報道，因此本研究對此做了進一步的探討。由于NP組織單個細胞懸液能夠更好地模擬體內NP的環(huán)境，本研究選擇此體系觀察了IL-23體外刺激對NP組織Th17反應的影響。IL-17是Th17通路的主要效應因子，可以誘導IL-8和G-CSF的生成，進而募集中性粒細胞的聚集和活化，而IL-1β主要參與Th17細胞的分化[12-14]。本研究顯示，IL-23能夠增強IL-17和IL-1β的生成，但是對IL-8和G-CSF的生成沒有影響，支持IL-23對CRSwNP中的Th17反應有正向調節(jié)作用。但是盡管Th17細胞是IL-17因子的主要來源，活化的CD8+T細胞[15]、中性粒細胞[16]和嗜酸性粒細胞[17]也能夠生成IL-17。NP組織單個細胞懸液雖然能夠更好地模擬體內NP的環(huán)境，但是由于此體系是多種細胞的混合，無法確定IL-23誘導IL-17生成的具體細胞，需要后續(xù)用特定的細胞進一步研究。

研究者[18-19]通常認為Th17反應能夠促進中性粒細胞炎性反應。而且，有研究[20]報道IL-23能夠不依賴IL-17促進小鼠腸炎模型中中性粒細胞的募集。筆者觀察了組織IL-23濃度與中性粒細胞的關系，結果顯示，鼻黏膜組織IL-23濃度與MPO濃度呈正相關，但是與組織和外周血中性粒細胞的數(shù)目無相關性。而且，筆者的前期研究[11]結果顯示，IL-17濃度也與MPO濃度呈正相關，但是與組織和外周血中性粒細胞的數(shù)目無相關性。與此一致，Choy等[21]在Th17亞型的哮喘中也未觀察到外周和組織中中性粒細胞數(shù)目的增多，這些結果支持Th17炎性反應中中性粒細胞的活性可能比數(shù)目更重要。

總之，IL-23在CRSsNP和IL-17陰性CRSwNP的發(fā)生中可能沒有發(fā)揮作用，但可能通過調節(jié)Th17通路參與了IL-17陽性CRSwNP的發(fā)生。