張培彪，柳常青，劉 忠，張貴民

（山東新時代藥業(yè)有限公司 山東省蛋白類藥物工程實驗室，山東 臨沂 273400）

粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）的主要作用是刺激中性粒細胞系（lineage）造血細胞的增殖、分化，增加外周血中性粒細胞數(shù)量，活化中性粒細胞功能。聚乙二醇化rhG-CSF（PEG-rhG-CSF）實現(xiàn)了長效增加外周血中性粒細胞數(shù)量的目的。PEG為高度水合的聚合物，每個甲氧基單元可結(jié)合1～2個水分子，力學半徑較大，可將被修飾蛋白的分子量提高約5～10倍。PEG修飾的蛋白質(zhì)和多肽類藥物在血液循環(huán)中的半衰期明顯延長，溶解度和穩(wěn)定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增強，藥物的毒副作用減少，明確改善rhG-CSF在臨床應(yīng)用中的局限性[1-2]。

蛋白質(zhì)含量測定是生物制品質(zhì)量控制的重要指標之一，準確的蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果不僅對相應(yīng)產(chǎn)品的分裝量有重要意義，且對比活性計算、殘留雜質(zhì)的限量控制及其他理化特性測定也有重要意義[3]。

目前國內(nèi)僅有rhG-CSF國家標準品，暫無PEG-rhG-CSF同質(zhì)標準品。即使未來PEG-rhG-CSF標準品上市銷售，往往因數(shù)量和成本的限制，企業(yè)很難有足夠數(shù)量的標準品用于檢驗。因此監(jiān)管機構(gòu)和檢驗機構(gòu)鼓勵企業(yè)通過自制的方式，獲得足夠數(shù)量的對照品，并用國家標準品進行標定。本文用自制的高純度原液，制備了PEG-rhG-CSF工作對照品，進行全面檢定和結(jié)構(gòu)確證，并對其進行協(xié)同標定，標定結(jié)果符合統(tǒng)計學要求，制備和標定過程對于企業(yè)進行自制對照品具有一定的指導意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

Cogent M1超濾系統(tǒng)（默克密理博）；灌裝泵（Flexicon公司產(chǎn)品）；Telstar 3PS凍干機（西班牙泰仕達）；凱氏定氮儀，多功能酶標儀（BMG公司）；XevoG2-XS QTof高分辨質(zhì)譜儀（Waters公司）；Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀（Waters公司）；PPSQ-33A/B全自動蛋白質(zhì)多肽測序儀（Shimadzu公司）；5800 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（AB Sciex公司）。

1.2 材料

PEG-rhG-CSF原液，由山東新時代藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，各項檢測指標均符合要求；甘露醇（青島明月海藻集團有限公司）；枸櫞酸和枸櫞酸三鈉（湖南爾康制藥股份有限公司）；聚山梨酯80（南京威爾藥業(yè)有限公司）。

2 方法

2.1 工作對照品制備

2.1.1 原液換液稀釋 將PEG-rhG-CSF原液進行超濾換液，置換液為10 mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液，pH 4.0。置換后的原液加入甘露醇80 mg/ml，并用10 mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸三鈉緩沖液將PEG-rhG-CSF稀釋至1 mg/ml。

2.1.2 對照品分裝 將灌裝泵標定6次，至灌裝精度1 %以內(nèi)。用Flexicon自動灌裝系統(tǒng)將PEG-rhG-CSF分裝至2 ml西林瓶中，每瓶裝量1 ml。

2.1.3 凍干 每個西林瓶進行半壓塞，轉(zhuǎn)移至凍干機凍干，執(zhí)行表1凍干程序。

表1 凍干程序

凍干結(jié)束后充氮，加塞軋蓋。將所得樣品取樣進行檢定，檢定合格后標定蛋白質(zhì)含量，即可作為工作對照品使用。

2.2 工作對照品檢定

參考《中國藥典》2015年版四部通則中的方法進行外觀檢查、蛋白質(zhì)含量測定、生物學活性測定、等電點測定、紫外光譜掃描、外源性DNA殘留測定、宿主菌蛋白質(zhì)殘留量測定、無菌檢查、細菌內(nèi)毒素檢查。

電泳法純度測定：照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（《中國藥典》2015年版四部通則0541第五法），用非還原型電泳法測定，分離膠濃度為15 %。

反相色譜法（RP-HPLC）純度測定：按《中國藥典》2015年版四部通則0512，色譜柱采用丁烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相流速1 ml/min，檢測波長214 nm。

分子排阻色譜法純度測定：采用T S K G3000SWXL凝膠分析柱，流動相流速0.5 ml/min，檢測波長214 nm。

PEG殘留量測定：采用HPLC串聯(lián)蒸發(fā)光檢測器方法，以丁烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，蒸發(fā)光檢測器參數(shù)：溫度113.0 ℃，撞擊器關(guān)（impactor off），載氣流速3.1 L/min。

PEG修飾度測定：采用HPLC，紫外檢測器與示差檢測器聯(lián)用。

2.3 工作對照品結(jié)構(gòu)確證

飛行時間質(zhì)譜精確相對分子質(zhì)量測定、HPLC質(zhì)量肽圖、N-末端氨基酸序列、二硫鍵配對分析：委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）測定工作對照品的精確相對分子質(zhì)量，在正離子模式下選擇線性方法測試樣品分子量，原始數(shù)據(jù)及圖譜由4000 Series Explorer V3.5軟件導出。

H P L C質(zhì)量肽圖：供試品經(jīng)胰蛋白酶（trypsin）酶解處理后采用超高效液相色譜系統(tǒng)（Acquity UPLC I-Class）分離。脫鹽及分離后用XevoG2-XS QTof質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜檢測分析，原始數(shù)據(jù)使用UNIFI（1.8.2，Waters）軟件查庫比對后得到結(jié)果。

N-末端氨基酸序列：樣品用Edman降解法處理后用全自動蛋白質(zhì)多肽測序儀（PPSQ-33A）測定。

二硫鍵配對分析：供試品經(jīng)酶解處理后經(jīng)超高效液相系統(tǒng)（Acquity UPLC I-Class）分離。脫鹽及分離后用質(zhì)譜儀（XevoG2-XS QTof）檢測。

質(zhì)譜檢測分析：用UNIFI（1.8.2，Watersr）軟件查庫，結(jié)合軟件和附加的人工解析，獲得了二硫鍵配對信息。

2.4 凱氏定氮標定

按2015年版《中國藥典》四部進行。選取3個不同實驗室，每個實驗室抽取12支樣品，用凱氏定氮法標定蛋白質(zhì)含量，分析36次測定結(jié)果，計算平均值、標準差、方差、95 %置信區(qū)間。

3 結(jié)果

3.1 工作對照品常規(guī)檢測結(jié)果

工作對照品檢驗結(jié)果見表2、表3。該批工作對照品的裝量差異為0.3 %，殘留水分為0.6 %，滿足2015年版《中國藥典》規(guī)定的國家標準品要求（裝量差異±1 %以內(nèi)、殘留水分不高于3.0 %）。其余外觀、可見異物、溶解度、無菌檢查均符合現(xiàn)行版藥典要求。

該批對照品的電泳法純度、反相HPLC純度、分子排阻色譜法純度等主要純度指標均大于99.5 %，見圖1、圖2。其余蛋白含量、等電點、比活性、PEG殘留、修飾度等指標均符合相關(guān)技術(shù)指導原則要求[4-6]。

表2 工作對照品檢定結(jié)果

表3 工作對照品檢定結(jié)果

圖1 PEG-rhG-CSF工作對照品分子排阻色潽法圖譜

圖2 PEG-rhG-CSF工作對照品反相色潽法圖譜

3.2 工作對照品結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

工作對照品結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果見表4。該批工作對照品的精確相對分子質(zhì)量（見圖3）、質(zhì)量肽圖、N-端氨基酸序列、二硫鍵分析、游離巰基、PEG位點確證等均與理論符合。

表4 工作對照品結(jié)構(gòu)確證結(jié)果

圖3 MALDI-TOF-MS測定PEG-rhG-CSF工作對照品相對分子質(zhì)量

3.3 工作對照品標定結(jié)果

該批工作對照品的凱氏定氮標定結(jié)果見表5。3個實驗室標定的均值為1.9595，1.9264，1.9158 mg/支，與Lowry法檢驗結(jié)果基本一致（1.95 mg/支），統(tǒng)計學分析差異無統(tǒng)計學意義。

共計36次標定結(jié)果統(tǒng)計表明，該對照品的平均值為1.9339 mg/支，標準差為0.02295 mg/支，RSD=1.19 %，95 %的置信區(qū)間：1.9261～1.9417 mg/支。

4 討論

本文制備的工作對照品選用工藝穩(wěn)定的商業(yè)化產(chǎn)品，選擇純度較高的原液批次，經(jīng)檢驗合格后，進行配制、分裝、凍干。嚴格控制配制環(huán)境和分裝環(huán)境的微生物和房間濕度。選用分裝精度高的分裝設(shè)備，控制裝量差異。摸索合適的凍干工藝，嚴格控制工作對照品的殘留水分。

按上述要求制備的PEG-rhG-CSF工作對照品，經(jīng)檢測，主要純度指標、體外生物學活性均優(yōu)于已上市的PEG-rhG-CSF注射液，其余指標也均符合相應(yīng)的標準要求[4]。

表5 工作對照品凱氏定氮標定結(jié)果

目前該工作對照品的長期穩(wěn)定性已完成24個月的考察，主要監(jiān)控項目如活性、純度及高分子物質(zhì)含量、PEG殘留等無顯著變化。又因該工作對照品為凍干粉，儲存條件-20 ℃以下，所以理論上本品的儲存期大于注射液的儲存期（2～8 ℃下2年）。

綜上所述，本文制備的工作對照品，各項指標均符合相關(guān)要求，可用于PEG-rhG-CSF原液、注射液等鑒定、含量測定及各種理化項目檢測。目前國內(nèi)只有rhG-CSF相關(guān)的含量、活性國家標準品，暫無市售的PEG-rhG-CSF國家標準品。本文通過嚴格的制備、檢驗、鑒定、標定過程，獲得符合相關(guān)標準的工作對照品，用于中試研究及生產(chǎn)過程的檢驗，為企業(yè)自制工作對照品提供參考。