（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東 濟(jì)寧 272100）

注射用鹽酸頭孢替安是第二代頭孢菌素類抗生素，為鹽酸頭孢替安原料加適量助溶劑碳酸鈉制成的注射用無菌粉末。臨床上，該品種廣泛應(yīng)用于敏感菌導(dǎo)致的各種感染性疾病，最早由日本武田藥業(yè)研制成功并上市[1]。本品屬β-內(nèi)酰胺類抗生素，為減少過敏反應(yīng)，必須控制內(nèi)源性高分子雜質(zhì)[2-3]。目前已有有關(guān)注射用鹽酸頭孢替安聚合物測定方法的報道，大多采用 G-10凝膠色譜柱[4-5]進(jìn)行檢測，但頭孢替安在水中締合差，常采用頭孢他啶或頭孢曲松等替代頭孢替安作為對照品，不能實現(xiàn)用頭孢替安自身作為對照品直接測定，且存在柱效低、分離效果差、費(fèi)時費(fèi)力、成本高、靈敏度差等缺點。目前不少文獻(xiàn)報道了高效分子排阻色譜法（HPSEC）[6-7]測定抗生素中聚合物含量的方法，與傳統(tǒng)的G-10凝膠法相比，該法靈敏度高、簡便易行、不需要經(jīng)常對色譜柱進(jìn)行活化處理，可實現(xiàn)對頭孢類抗生素中高聚物的快速分析。本實驗采用分子排阻色譜法來檢測注射用鹽酸頭孢替安中的高分子雜質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)Ⅱ）的含量，并通過系統(tǒng)研究驗證了該分析方法的可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

賽默飛Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國熱電公司）；梅特勒-托利多AB265-S電子天平（梅特勒·托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

頭孢替安對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130565-200902，含量80.7 %）；3批原研樣品（日本武田藥業(yè)，批號：C43113，C43111，CL0947）；12批注射用鹽酸頭孢替安（批號：170101～170112）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團(tuán)）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：TSK-GEL 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 μm）；流動相：pH 7.0的0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液[磷酸氫二鈉溶液-磷酸二氫鈉溶液（50:50)]-乙腈=90:10；柱溫：25 ℃，檢測波長：254 nm，進(jìn)樣量：10 μl。

2.1.2 溶液的制備 對照品溶液：精密稱定頭孢替安對照品適量，以流動相溶解并稀釋制成10 μg/ml（以頭孢替安計）的溶液。

供試品溶液（臨用新制）：精密稱定注射用鹽酸頭孢替安樣品內(nèi)容物適量，以流動相溶解并稀釋制成每毫升約含頭孢替安1 mg的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取注射用鹽酸頭孢替安樣品內(nèi)容物適量，用流動相溶解并制成每毫升約含頭孢替安1 mg的溶液，80 ℃水浴中加熱2 min，冷卻至室溫。

靈敏度溶液：精密量取10 μg/ml的頭孢替安對照品溶液1 ml，用流動相定量稀釋成每毫升約含頭孢替安0.2 μg的溶液。

2.1.3 有關(guān)物質(zhì)II測定 分別精密量取2.1.2項下對照品溶液、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液、靈敏度溶液各10 μl進(jìn)樣。系統(tǒng)適用性溶液中頭孢替安峰與相對保留時間約為0.95的降解產(chǎn)物峰間的分離度應(yīng)符合要求，靈敏度溶液主成分色譜峰峰高的信噪比應(yīng)大于10；以外標(biāo)法計，供試品溶液色譜圖中保留時間小于頭孢替安峰的雜質(zhì)總量不得過標(biāo)示量的2.0 %，小于靈敏度溶液主峰面積的雜質(zhì)峰可忽略不計。

2.2 分析條件的優(yōu)化

通過對流動相、波長、溶劑、進(jìn)樣量等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳試驗條件。

2.2.1 流動相的選擇 為了考察流動相中乙腈比例對檢測結(jié)果的影響，分別考察0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液、0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液:乙腈=95:5、0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液:乙腈=90:10為流動相時對分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈比例為10 %時，主峰及主峰前雜質(zhì)的峰形最好，主峰前的雜質(zhì)數(shù)最多，有關(guān)物質(zhì)Ⅱ含量相對最大（色譜圖見圖1）。為考察流動相中磷酸鹽濃度的影響，固定乙腈比例為10 %，分別比較當(dāng)磷酸鹽濃度為0.005 mol/L和0.01 mol/L時的分離效果，發(fā)現(xiàn)0.005 mol/L的磷酸鹽可檢出的雜質(zhì)含量較大，且流動相中含鹽濃度低，對色譜柱壽命影響相對較小，更符合方法學(xué)要求。

圖1 注射用鹽酸頭孢替安有關(guān)物質(zhì)II檢測圖譜

2.2.2 檢測波長的選擇 采用PDA檢測器，對頭孢替安及其主峰前雜質(zhì)（雜質(zhì)1～雜質(zhì)7及相對保留時間約為0.95的熱破壞降解雜質(zhì)8，見圖2）在200～400 nm波長內(nèi)進(jìn)行掃描，評價主峰及主峰前雜質(zhì)的紫外吸收行為。實際測得頭孢替安最大紫外吸收波長為254 nm，保留時間小于頭孢替安的雜質(zhì)在254 nm處均有較明顯吸收，故選擇254 nm為測定波長是合理的。

2.2.3 溶劑選擇 本品由于添加了輔料碳酸鈉，易溶于水，分別采用水和流動相作為空白溶劑，比較二者的色譜行為。結(jié)果表明，以水做空白溶劑時，所得圖譜有小的倒峰出現(xiàn)，而流動相則未檢出任何峰，不會對檢測產(chǎn)生干擾，因此選擇流動相為溶劑更佳。

圖2 注射用鹽酸頭孢替安有關(guān)物質(zhì)II系統(tǒng)適用性圖譜

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 分別取本品及碳酸鈉各適量，分別取經(jīng)高溫降解（80 ℃水浴加熱2 min）、酸降解（2 mol/L鹽酸溶液破壞40 min）、堿降解（0.1 mol/L氫氧化鈉溶液破壞15 min）、強(qiáng)光照射（4500±500 lx強(qiáng)光下放置6.5 h）、氧化降解（3 %過氧化氫溶液破壞10 min）后制成的溶液，結(jié)果表明，輔料碳酸鈉在各降解條件下均不影響測定；本品在以上破壞條件下均不穩(wěn)定，產(chǎn)生的各降解產(chǎn)物峰與頭孢替安峰分離度均＞1.5，各檢測溶液中主峰純度匹配指數(shù)均大于980，說明主峰的純度符合要求，未包裹其他雜質(zhì)峰，該方法的專屬性良好，見圖3（熱破壞見圖2）。

圖3 注射用鹽酸頭孢替安溶液破壞圖譜

2.3.2 進(jìn)樣精密度 取10 μg/ml的頭孢替安對照品溶液，按2.1項下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測得主峰峰面積的RSD為0.50 %。

2.3.3 定量限與檢測限 取頭孢替安對照品溶液，采用逐步稀釋的方法，信噪比（S/N）=10的樣品濃度即為定量限，信噪比（S/N）=3的溶液濃度即為檢測限。結(jié)果定量限溶液的濃度為0.03 μg/ml，檢測限溶液的濃度為8.02 ng/ml，6份定量限溶液峰面積的RSD為3.69 %。

2.3.4 對照品溶液線性關(guān)系與范圍 以20 μg/ml的頭孢替安對照品溶液為儲備液，分別精密量取該儲備液0.1，1.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0 ml于10 ml量瓶，以流動相稀釋并定容至刻度，作為線性溶液。結(jié)果表明，頭孢替安在0.19～19.05 μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.4131X-0.0070，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9999。

2.3.5 有關(guān)物質(zhì)Ⅱ總峰面積與頭孢替安濃度的線性關(guān)系 分別取供試品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 ml含頭孢替安0.4，0.8，1.0，1.2，1.4，1.8 mg的溶液，作為不同濃度的線性溶液。分別取上述各線性溶液10 μl進(jìn)樣分析，求算各線性溶液濃度與響應(yīng)值（主峰前有關(guān)物質(zhì)Ⅱ峰面積總和）回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，供試品溶液在濃度為0.38～1.86 mg/ml的范圍內(nèi)與頭孢替安有關(guān)物質(zhì)Ⅱ總峰面積具有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=2.2800X-0.0513，相關(guān)系數(shù)r為0.9999。

2.3.6 重復(fù)性與中間精密度 兩位分析員分別配制6份供試品溶液和2份頭孢替安對照品溶液，在不同時間，采用兩臺不同儀器，取供試品溶液和對照品溶液各10 μl，分別進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，兩位分析員6次測定重復(fù)性RSD分別為1.42 %和1.31 %，不同分析員12次測定中間精密度的RSD為1.60 %。

2.3.7 溶液穩(wěn)定性試驗 將供試品溶液分別在室溫和4 ℃環(huán)境下放置，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：有關(guān)物質(zhì)Ⅱ總峰面積隨時間延長逐漸變大；室溫下，聚合物含量增長較快，說明溫度影響其穩(wěn)定性。因此，供試液需臨用新制，或低溫放置一定時間內(nèi)進(jìn)樣。

2.3.8 耐用性 分別改變波長±5 nm、流速±0.1 ml/min、柱溫± 2 ℃、流動相pH± 0.2、流動相配比±2 %、色譜柱批號等色譜條件，評價波長、流速、柱溫、pH值、流動相配比、色譜柱批號改變后對實驗結(jié)果影響程度。結(jié)果表明，與原色譜條件比，檢測結(jié)果相對偏差（RD）均小于5 %；說明色譜條件略有變化時，對檢測沒有影響，該方法檢測鹽酸頭孢替安有關(guān)物質(zhì)Ⅱ耐用性良好。

2.4 樣品檢測

取12批某公司生產(chǎn)的注射用鹽酸頭孢替安樣品及日本武田生產(chǎn)的3批樣品，按2.1項下方法進(jìn)樣檢測，結(jié)果見表2。

表1 注射用鹽酸頭孢替安有關(guān)物質(zhì)II溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

表2 注射用鹽酸頭孢替安有關(guān)物質(zhì)II樣品檢測結(jié)果

3 討論

由于頭孢類抗生素在TSK-GEL 2000SWXL色譜柱中，除分子排阻作用外，還可能存在吸附作用，保留時間并非嚴(yán)格按照分子排阻原理，因此主峰前的雜質(zhì)峰不僅包括了高分子聚合物，還可能包括其他極性大的小分子雜質(zhì)，參考《中國藥典》2015年版（二部）正文中頭孢地嗪鈉、頭孢米諾鈉、法羅培南鈉等品種[8]，將主峰前的雜質(zhì)峰總和統(tǒng)稱為有關(guān)物質(zhì)Ⅱ。系統(tǒng)的方法學(xué)研究表明，該法操作簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果可靠，適用于注射用鹽酸頭孢替安中有關(guān)物質(zhì)Ⅱ的快速檢測。由于注射用鹽酸頭孢替安室溫下溶液穩(wěn)定性較差，因此需臨用新制或低溫儲存。