孟 琦 ，寶 麗，張 燁，張 蕾，王真真，鄢 丹*，孟祥樂

（1. 河南大學 藥學院，河南 開封 475000；2. 首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院 臨床合理用藥生物特征譜學評價北京市重點實驗室暨國際合作聯(lián)合實驗室，北京 100038；3. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000）

中國已成為世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國家，研制安全有效、毒副作用小、價格低廉的防治糖尿病的藥物已成為熱點和難點[1]。近年，中醫(yī)藥或其有效成分在治療2型糖尿病方面臨床療效確切，且具有較低的副作用，如瀉心湯[2]，黃連解毒湯[3]，黃芪散[4]等。其中黃連經(jīng)常與黃芪配伍使用，尤其是黃芪用于治療糖尿?。ㄖ嗅t(yī)稱為消渴癥），早在《名醫(yī)別錄》就明確提出了黃芪有“止渴”作用，其后《日華子本草》指出黃芪治療消渴。現(xiàn)在臨床亦多用黃芪配伍其他中藥辨證治療消渴?，F(xiàn)有靜脈注射劑（主要活性成分是黃芪甲苷），用于治療2型糖尿病臨床療效良好[5]。另外，黃連（主要活性成分為小檗堿）因其有降血糖、降血脂、抗炎和抗氧化作用，經(jīng)常用于治療2型糖尿病[6]。根據(jù)中國食品藥品監(jiān)督管理局數(shù)據(jù)，黃連多作為抗糖尿病中成藥的主要成分，且大多數(shù)與黃芪配伍，如金芪降糖片、糖脈康膠囊、消渴平片等[7]。盡管黃連和黃芪配伍被頻繁用于抗糖尿病配方中，但目前它們之間的相互作用關(guān)系還不清晰。

當前，將腸道菌群作為靶點，從中藥中尋找治療2型糖尿病的活性成分或組方已成為開發(fā)新藥的新途徑[8]。黃芪的主要活性成分黃芪甲苷，有抗糖尿病、抗炎、抗氧化、提高機體免疫力等多種藥理活性[9]。黃連的主要活性成分小檗堿有降血糖作用[10]，由于其吸收率和生物利用度較低，所以本實驗認為其降血糖作用可能不是在吸收之后產(chǎn)生的，而是在腸道中發(fā)揮作用[11]。因此，本文通過單獨和聯(lián)合灌胃給予小檗堿、黃芪甲苷治療2型糖尿病大鼠2周[12]，然后收集其糞便進行16S rRNA測序，并對腸道菌群結(jié)構(gòu)進行分析，以研究小檗堿和黃芪甲苷聯(lián)合使用對2型糖尿病大鼠的降糖機制，從而解釋了不同中藥成分之間的相互作用及配伍機制。

1 材料

1.1 實驗動物

Sprague Dawley（SD）雄性大鼠25只，SPF級，6周齡（實驗動物合格證號：1100111911013013），購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號SCXK（京）2016-0006]，飼養(yǎng)于北京世紀壇醫(yī)院動物房[許可證號SYXK（京）2017-0025]。飼養(yǎng)條件：SPF級潔凈度，室溫 20～22 ℃，濕度60 %±5 %，12 h明暗交替，自由飲食飲水。本實驗中所有動物程序都被首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院倫理委員會認可（許可號：2019-keyanlunshen-21），并在實驗動物保護協(xié)會規(guī)定的指導下進行動物實驗。

1.2 藥品、試劑與儀器

鹽酸小檗堿（純度≥97 %，大連美侖生物技術(shù)公司）；黃芪甲苷（純度＞95 %，上海源葉生物科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉，鏈脲佐菌素（生化試劑，Sigma公司）；維持飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司）；高脂飼料（含10 %蛋黃粉，10 %蔗糖，10 %豬油和10 %膽固醇，北京華阜康股份有限公司）。血糖儀及試紙（德國羅氏診斷有限公司）；T100型PCR儀（Bio-rad公司）；高通量測序分析儀（IonS5TMXL Ion 530 Chip，Thermofisher公司）。

2 方法

2.1 動物造模、分組與給藥

用維持飼料飼養(yǎng)SD大鼠，適應1周后，所有25只大鼠均以高脂飲食飼養(yǎng)4周。然后腹腔內(nèi)注射45 mg/kg鏈脲佐菌素溶液（溶于pH 4.5 0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液），72 h后，空腹血糖（FBG）≥11.1 mmol/L被確定為糖尿病模型造模成功[13-14]。將造模成功的大鼠隨機分為4組：模型（BL）組、黃芪甲苷（AIV）組、小檗堿（BBR）組和黃芪甲苷與小檗堿聯(lián)合用藥組（AB）。將所有藥物溶解于0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液中。連續(xù)灌胃給藥2周。在全部試驗過程中，每周記錄一次體重、空腹血糖。未建模的大鼠用10 %水合氯醛麻醉處死。

2.2 動物糞便收集、DNA提取、PCR擴增及測序

給藥結(jié)束后，收集大鼠糞便，取糞便方法為一人托持大鼠，另一人待其排便時用無菌棉簽輔助將新鮮糞便接入無菌凍存管中，立刻放入液氮，過程中盡量避免雜菌污染，收集完成后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存。用CTAB/SDS法從糞便樣品中提取總基因組DNA。腸道內(nèi)容物DNA提取按DNA提取試劑盒說明進行，使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。對提取的DNA進行PCR擴增，本實驗選用的擴增引物為515F-806R，其中515F序列為5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，806R序列為5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。擴增程序為95 ℃預變性5 min，34個循環(huán)（94 ℃變性1 min，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃延伸10 min，16 ℃保溫5 min。擴增后的產(chǎn)物使用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取目的條帶，使用凝膠回收試劑盒回收?；厥蘸蟮臄U增產(chǎn)物使用Tris-HCl洗脫收集，定量后按比例混合不同樣品的擴增產(chǎn)物。采用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度將樣品等量混合，使用TAE濃度為1 % 的2 %瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，剪切回收目標條帶。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒（Thermofisher公司）進行文庫的構(gòu)建，經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后，使用 IonS5TMXL 測序平臺（Thermofisher）上機測序，以97 %的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），然后對OTUs序列與Silva132數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。

2.3 生物信息分析

為計算alpha、beta多樣性，使用R軟件（2.15.3版）計算Shannon指數(shù)，并進行主坐標分析（PCoA）；為挖掘反映樣品之間差異的更深層微生物多樣性數(shù)據(jù)，使用LEfSe方法進行豐度顯著差異分類單元篩選，判別標準為：Kruskal-Wallis檢驗篩選值α＜0.05，配對Wilcoxon檢驗篩選值α＜0.05，顯著判別值LDA＞3.5；代謝通路預測使用PICRUSt。

2.4 統(tǒng)計分析

采用 GraphPad Prism 7.0進行組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，多組間的顯著性差異統(tǒng)計采用單因素方差分析（ANOVA）。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示均采用±s表示。P＜0.05的差異被認為是具有統(tǒng)計學意義，本文的顯著性水平表示為*P＜0.05，**P＜0.01 和***P＜0.001。處理后的數(shù)據(jù)再使用 GraphPad Prism 7.0作圖。組間LEfse比率通過非參數(shù)Kruskal-Wallis rank sum檢驗分析。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠血糖和體重的影響

2周灌胃給藥結(jié)束時，空腹血糖方面，與模型組相比，黃芪甲苷組、小檗堿組和聯(lián)合用藥組的平均血糖均降低，其中聯(lián)合用藥組的平均血糖（18.79 ± 3.27 mmol/L，每組5只2型尿病大鼠）顯著低于模型組（20.86 ± 4.35 mmol/L，每組5只2型糖尿病大鼠）（*P＜0.05）（圖1A）。在體重方面，與模型組相比，黃芪甲苷組、小檗堿組和聯(lián)合用藥組的平均體重均增加，其中小檗堿組（329.90 ±50.06 g）、聯(lián)合用藥組（331.94 ± 49.87 g）分別比模型組（318.07 ± 39.29 g）增加3.71 %（*P＜0.05）和4.05 %（*P＜0.05）（圖1B）。上述結(jié)果表明，聯(lián)合用藥有效改善了2型糖尿病大鼠的空腹血糖和體重。

圖1 黃芪甲苷（AIV）、小檗堿（BBR）及聯(lián)合用藥（AB）組的2型糖尿病大鼠空腹血糖和體重變化圖

3.2 黃芪甲苷與小檗堿聯(lián)合用藥對2型糖尿病大鼠微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

為比較不同樣本的多樣性，首先對OTU豐度矩陣中的全部樣本根據(jù)最低測序深度統(tǒng)一進行隨機重抽樣，即“序列量拉平處理”，從而校正測序深度引起的多樣性差異。Alpha多樣性（alpha diversity）反映的是單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，可通過群落多樣性指數(shù)衡量，Shannon是表示群落多樣性指數(shù)的一種形式，此指數(shù)值越大，表明樣品的物種多樣性越高。由圖2A Shannon指數(shù)可見，黃芪甲苷組、小檗堿組、聯(lián)合用藥組和模型組相比較群落多樣性均減少，且小檗堿組（*P＜0.05）、聯(lián)合用藥組（**P＜0.01）與模型組的差異有統(tǒng)計學意義。

本研究試圖從腸道菌群結(jié)構(gòu)出發(fā)，探討小檗堿與黃芪甲苷合用對菌群結(jié)構(gòu)的影響，進而推測黃連與黃芪配伍使用的作用機制。由圖2B，圖3，圖4可見，給藥2周后，黃芪甲苷、小檗堿及聯(lián)合用藥均能引起腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。

在門水平上，豐度較高的菌群依次為Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Tenericutes（柔壁菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Melainabacteria（麥角藻菌門）、Deferribacteres（脫鐵桿菌門）、Elusimicrobia（迷蹤菌門）和Cyanobacteria（藍細菌）。其中厚壁菌門與擬桿菌門具有絕對優(yōu)勢。小檗堿組和聯(lián)合用藥組的Bacteroidetes豐度比模型組分別高13.32 %、26.90 %；而黃芪甲苷組的Bacteroidetes豐度比模型組低5.04 %；Firmicutes豐度比模型組分別低19.80 %，7.41 %，4.54 %（圖3）。

在屬水平上，豐度較高的菌群依次為Bifidobacterium、Lactobacillus、Turicibacter、unidentified Ruminococcaceae、Bacteroides、unidentified Lachnospiraceae、Anaeroplasma、Faecallibaculum、Akkermansia和Marvinbryantia（圖4）。

圖2 黃芪甲苷（AIV）、小檗堿（BBR）及聯(lián)合用藥（AB）組2型糖尿病大鼠糞便腸道菌群的Shannon（A）及PCoA分析圖（B）

圖3 黃芪甲苷（AIV）、小檗堿（BBR）及聯(lián)合用藥（AB）組2型糖尿病大鼠腸道菌群在門水平的物種分布

圖4 黃芪甲苷（AIV）、小檗堿（BBR）及聯(lián)合用藥（AB）組2型糖尿病大鼠腸道菌群在屬水平的物種分布

3.3 差異菌屬篩選及藥物調(diào)節(jié)作用

通過Galaxy在線分析平臺（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/），提交相對豐度矩陣進行LEfSe分析[15]，顯示細菌豐度的差異。LDA評分的閾值為3.5，結(jié)果見圖5。與模型組相比，黃芪甲苷組、小檗堿組、聯(lián)合用藥組的大鼠腸道菌群中門、綱、目、科和屬分類水平均發(fā)現(xiàn)差異菌群。Romboutsia屬和Lactobacillus reuteri種在黃芪甲苷組呈上調(diào)趨勢，unidentified Ruminococcaceae屬、Ruminococcus spYE281種和Bacteroides intestinalis種在小檗堿組呈上調(diào)趨勢，Akkermansia屬和Parabacteroides屬在聯(lián)合用藥組呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，但Proteobacteria菌的豐度在模型組中增多。

圖5 黃芪甲苷（AIV）、小檗堿（BBR）及聯(lián)合用藥（AB）組造成的差異菌屬進化分支圖（A）和線性判別分析（LDA）得分（B）圖

3.4 代謝功能預測

為了進一步分析腸道菌群的功能信息，使用PICRUSt軟件進行功能預測，富集到的通路見圖6。根據(jù)聚類結(jié)果可見，其中Metabolism of Cofactors and Vitamins（輔酶和維生素的代謝）、Nucleotide Metabolism（核苷酸代謝）、Metabolism of Other Amino Acids（其他氨基酸代謝）等功能在黃芪甲苷給藥組中呈上調(diào)趨勢；Metabolic Diseases（代謝性疾?。?、Amino Acid Metabolism（氨基酸代謝）、Metabolism of Terpenoids and Polyketides（萜類化合物和多聚酮類的代謝）等功能在小檗堿給藥組中呈上調(diào)趨勢和Glycan Biosynthesis and Metabolism（聚糖生物合成代謝）、Metabolism（代謝）等功能在聯(lián)合用藥組中呈上調(diào)趨勢。

圖6 黃芪甲苷（AIV）、小檗堿（BBR）及聯(lián)合用藥（AB）組2型糖尿病大鼠腸道菌群功能通路預測圖

4 討論

本文發(fā)現(xiàn)黃連的主要活性成分小檗堿和黃芪的主要成分黃芪甲苷聯(lián)合使用比各自單獨使用能更好地降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖，但由于其生物利用度很低，腸道菌群可能是其治療2型糖尿病的作用靶點之一。本研究從腸道菌群結(jié)構(gòu)分析入手，篩選豐度顯著差異分類單元并預測其代謝通路，探究服用小檗堿、黃芪甲苷對2型糖尿病大鼠腸道菌群調(diào)節(jié)的生物學意義，從而推測黃連與黃芪配伍使用的作用機制。

在服用小檗堿、黃芪甲苷后，2型糖尿病大鼠門水平腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，Bacteroidetes平均豐度上升、Firmicutes平均豐度下降，其中聯(lián)合用藥組的變化尤為明顯。目前大部分研究認為Bacteroidetes下降與Firmicutes上升是肥胖發(fā)生的標志之一[16-17]，由此作者推測含小檗堿與黃芪甲苷聯(lián)合用藥可能具有減緩肥胖及糖尿病等代謝疾病發(fā)展過程的作用。

本研究結(jié)果所揭示的灌胃黃芪甲苷、小檗堿后2型糖尿病大鼠腸道菌群門、綱、目、科、屬、種水平豐度顯著差異分類單元中，Proteobacteria菌增加將導致腸道內(nèi)毒素產(chǎn)量增加，從而擾亂腸道免疫功能，或損傷腸黏膜[18]或引起代謝性內(nèi)毒素血癥，代謝性內(nèi)毒素血癥已被認為是引發(fā)肥胖癥和肥胖相關(guān)功能障礙的主要原因[19]。unidentified_Ruminococcaceae屬，主要產(chǎn)丁酸鹽菌，丁酸鹽是一種短鏈脂肪酸，在維持腸道屏障功能和抵御病原菌感染上起重要作用，并參與機體的免疫調(diào)節(jié)[20]。Akkermansia屬疣微菌科（Verrucomicrobiaceae），是人體腸道中一種可降解黏蛋白的細菌，幫助維持消化道健康，降低肥胖、糖尿病、炎癥等疾病的風險，研究表明，其通過改變脂肪組織的代謝，改善腸道屏障的完整性[21-22]。Parabacteroides屬主要代謝終產(chǎn)物為有益的乙酸、琥珀酸，幫助調(diào)節(jié)腸道菌群[23]。unidentified_Ruminococcaceae屬、Akkermansia屬、Parabacteroides屬均是有益菌，在給藥組中豐度增多，而Proteobacteria菌是致病菌，在模型組中的豐度高。

由此可見，黃連、黃芪的主要活性成分小檗堿、黃芪甲苷可使2型糖尿病大鼠致病菌和條件致病菌豐度下降、益生菌和潛在益生菌豐度上升；尤其是聯(lián)合用藥能顯著調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，表明黃芪甲苷可通過改善腸道菌群促進小檗堿降血糖的發(fā)揮。同時受聯(lián)合用藥調(diào)節(jié)的腸道菌群多與糖尿病病、肥胖等代謝相關(guān)疾病有關(guān)，通路預測結(jié)果中氨基酸代謝、聚糖生物合成代謝等功能均發(fā)生了變化，這可為進一步研究黃連、黃芪聯(lián)合用藥改善胰島素抵抗、抗糖尿病[24]的作用機制提供新的思路。