向曉輝 毛駿 李海

1天津市西青醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300380；2武警后勤學(xué)院研究生隊，天津 300309；3天津市肝臟胰腺纖維化與分子診療重點實驗室，天津 300162

胰腺癌是一種惡性程度很高、診斷和治療都很困難的消化腺惡性腫瘤，起病隱匿，早期癥狀不典型，出現(xiàn)癥狀時大多已屬中晚期[4]，預(yù)后差[1]。著絲粒蛋白(centromere protein，CENP)是一組形成、介導(dǎo)著絲粒功能的蛋白[6-7]，最早被發(fā)現(xiàn)的是CENP-A，由CENP-A基因編碼。CENP-A是一種組蛋白H3變體，對于著絲粒的組裝形成、染色體的正確分離以及細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行起到了不可替代的作用[8-10]。CENP-A在正常細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平受嚴(yán)格調(diào)控，對確保有絲分裂過程中基因組的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用[7, 11]。研究發(fā)現(xiàn)CENP-A基因在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，導(dǎo)致染色體非整倍體形成，而染色體非整倍體形成往往是腫瘤形成的重要原因之一[12]。本研究通過檢索高通量基因表達(dá)(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫和癌癥基因組圖集(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫，探討CENP-A在胰腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)來源

自GEO數(shù)據(jù)庫(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)的1個微陣列數(shù)據(jù)集(GSE28735)下載45例具有完整臨床隨訪信息的胰腺癌患者癌組織和癌旁組織mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)；自TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov/)下載178例胰腺癌患者癌組織的mRNA Seq數(shù)據(jù)，其中177例患者具有匹配的mRNA表達(dá)譜、生存數(shù)據(jù)和完整的臨床病理數(shù)據(jù)。

二、數(shù)據(jù)處理與患者分組

下載edge R軟件包(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)對mRNA表達(dá)譜進(jìn)行過濾、歸一化處理，并經(jīng)log2轉(zhuǎn)換后用于后續(xù)分析[13-14]?；赥CGA數(shù)據(jù)庫中177例胰腺癌樣本CENP-A mRNA表達(dá)譜和隨訪數(shù)據(jù)，對樣本的表達(dá)量進(jìn)行由高到低排序后，取中位數(shù)將其分為高表達(dá)、低表達(dá)2組。

三、CENP-A基因功能富集分析

使用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)軟件分析CENP-A mRNA表達(dá)水平與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路基因集的相關(guān)性[15-17]。設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次，計算標(biāo)準(zhǔn)化的富集系數(shù)(normallized enrichment score，NES)，以標(biāo)準(zhǔn)化P值<0.01，且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates，F(xiàn)DR)<0.05為顯著性富集。

四、CENP-A相關(guān)蛋白的篩選及相關(guān)性分析

STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting genes/proteins)數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)是一個研究分析蛋白之間相互作用的在線檢索生物數(shù)據(jù)庫，可用于尋找與CENP-A蛋白作用密切相關(guān)的多個蛋白，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。將STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果中的蛋白和本研究中的GSEA富集通路結(jié)果結(jié)合，篩選出與CENP-A相關(guān)的蛋白，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

癌組織與癌旁組織表達(dá)量比較采用配對樣本t檢驗，臨床病理指標(biāo)參數(shù)采用獨立樣本t檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗。對CENP-A表達(dá)與相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，并用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CENP-A在胰腺癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)

GEO數(shù)據(jù)庫下載的45例胰腺癌組織和相匹配的癌旁組織中CENP-A mRNA表達(dá)量分別為4.492±0.361和3.431±0.405，胰腺癌組織CENP-A mRNA表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.531，P=0.001，圖1)。

注：CENP-A為著絲粒蛋白A圖1 胰腺癌組織與匹配癌旁組織的CENP-A表達(dá)量

二、胰腺癌組織CENP-A表達(dá)量與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫下載的177例胰腺癌組織CENP-A基因表達(dá)量與TNM分期、腫瘤分級密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.035、0.007)，而與患者年齡、性別、飲酒史及腫瘤家族史均無明顯相關(guān)性(表1)。

三、CENP-A表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

CENP-A的表達(dá)水平與胰腺癌患者總體生存期顯著相關(guān)(P=0.001)，高表達(dá)患者與低表達(dá)患者的生存率分別為36.4%和59.6%，中位生存期分別為511 d和913 d，高表達(dá)患者總體生存時間顯著短于低表達(dá)患者，提示CENP-A基因高表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后不良的因素(圖2)。

四、CENP-A基因功能富集分析

CENP-A高表達(dá)組織樣本富集到細(xì)胞周期(P<0.001，F(xiàn)DR=0.004)與DNA周期(P<0.001，F(xiàn)DR=0.043)兩個相關(guān)基因集，提示CENP-A可能通過上述兩條通路發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用(圖3)。

臨床指標(biāo)例數(shù)CENP-A表達(dá)量t值P值年齡(歲)-0.9650.336 <65816.743±1.417 ≥65966.931±1.175性別0.4060.685 男976.888±1.202 女806.809±1.365腫瘤分級-2.7500.007 G1～G21256.663±1.349 G3～G4507.244±1.020 未知2TNM分期-2.2430.035 Ⅰ226.037±1.881 Ⅱ～Ⅳ1556.960±1.147飲酒史-0.6170.538 無706.771±1.019 有1076.893±1.443腫瘤家族史-0.6000.549 無896.787±1.444 有886.904±1.119

注：CENP-A為著絲粒蛋白A

注：CENP-A為著絲粒蛋白A圖2 CENP-A表達(dá)水平與胰腺癌患者生存時間的關(guān)系

五、與CENP-A密切相關(guān)的蛋白分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫分析構(gòu)建CENP-A蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent protein kinase, CDK1)、紡錘體檢測蛋白1(budding uninhibited by benzimidazoles 1, BUB1)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)激酶(aurora kinase A, AURKA)、AURKB等多個蛋白與CENP-A相互作用(圖4)，結(jié)合GSEA富集的細(xì)胞周期與DNA復(fù)制相關(guān)通路結(jié)果篩選出CDK1和BUB1兩個關(guān)鍵蛋白。應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析顯示胰腺癌組織CENP-A與CDK1、BUB1呈顯著相關(guān)性(r值分別為0.861、0.825，P值均<0.001，圖5)。

討 論

著絲粒是真核生物細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂和減數(shù)分裂時染色體分離的調(diào)控裝置，由DNA和蛋白質(zhì)組成。CENP-A作為著絲點的標(biāo)志性蛋白因子，在染色體精確分離過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18]。CENP-A功能失常將導(dǎo)致細(xì)胞分裂過程中發(fā)生染色體分離異常。在DNA復(fù)制過程中，染色質(zhì)可通過回收修飾舊的組蛋白和沉積新的組蛋白而重新組裝[19-20]。Nye等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中CENP-A的異常定位可以募集著絲粒組件，并與G1期的有絲分裂缺陷和DNA損傷相關(guān)。Takada等[22]的研究結(jié)果揭示了通過CENP-A介導(dǎo)的著絲粒功能障礙，被激活的細(xì)胞周期蛋白E1/CDK2促進(jìn)細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性和腫瘤的進(jìn)展。

注：CENP-A為著絲粒蛋白A

圖3 CENP-A基因高表達(dá)相關(guān)基因集的富集 3A:富集細(xì)胞周期基因集；3B:富集DNA復(fù)制基因集

注：CENP-A為著絲粒蛋白A；CDK1為周期蛋白依賴性激酶1；BUB1為紡錘體檢測蛋白1

圖4 CENP-A的PPI網(wǎng)絡(luò)

注：CENP-A為著絲粒蛋白A；CDK1為周期蛋白依賴性激酶1；BUB1為紡錘體檢測蛋白1

圖5 CENP-A與CDK1(5A)及BUB1(5B)的相關(guān)性分析

近年來研究發(fā)現(xiàn)，CENP-A在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，其過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等密切相關(guān)[12]。最近一項基于生物信息學(xué)的研究顯示CENP-A在淋巴瘤、平滑肌肉瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、鱗狀上皮細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、髓樣乳腺癌、乳腺導(dǎo)管癌、胃腸型腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、口咽癌、結(jié)腸癌、直腸癌、宮頸癌、卵巢漿液性囊腺癌、前列腺癌等20種不同類型的實體癌中表達(dá)升高[9]。越來越多的研究表明，CENP-A具有作為腫瘤診斷標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)的潛在應(yīng)用價值[23]。CENP-A是雌激素受體陽性乳腺癌復(fù)發(fā)的預(yù)后標(biāo)志物[24]，CENP-A表達(dá)增加可能導(dǎo)致乳腺癌患者的無病生存期縮短[25]?？谇击[狀細(xì)胞癌組織中CENP-A蛋白和mRNA的表達(dá)明顯高于正常組織，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能成為口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的生物標(biāo)志物[26]。CENP-A在11種主要的人原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中均過表達(dá)。CENP-A mRNA表達(dá)也上調(diào)，表明CENP-A的過表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，可能在結(jié)直腸癌的非整倍體形成中起重要作用[27]。

本研究借助GEO數(shù)據(jù)庫CENP-A基因表達(dá)譜證實胰腺癌組織CENP-A mRNA表達(dá)量較癌旁正常胰腺組織上調(diào)，表明CENP-A基因具備作為胰腺癌病理診斷標(biāo)志物的潛在價值。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫177例胰腺癌患者的CENP-A mRNA表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析CENP-A表達(dá)量與胰腺癌臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CENP-A表達(dá)水平與腫瘤分期和分級密切相關(guān)，與患者生存時間呈負(fù)相關(guān)，提示CENP-A基因有望成為胰腺癌患者預(yù)后判斷的新型分子標(biāo)志物，并將有助于胰腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測策略的完善。借助基因集富集分析發(fā)現(xiàn)CENP-A高表達(dá)組顯著富集于細(xì)胞周期和DNA復(fù)制兩條KEGG通路，進(jìn)一步結(jié)合與CENP-A相關(guān)蛋白的分析結(jié)果推測，CENP-A可能是通過與之相關(guān)的CDK1和BUB1協(xié)同在胰腺癌組織中發(fā)揮其生物學(xué)作用。

雖然本研究為深入探討CENP-A在胰腺癌中的作用提供了線索和依據(jù)，但尚未明確CENP-A參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制和途徑，由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在多基因協(xié)同的復(fù)雜調(diào)控作用，因此其在胰腺癌形成過程中發(fā)揮的功能還有待后續(xù)實驗予以進(jìn)一步闡明及豐富。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突