劉穎，張鵬，王鐵桿*，任鵬

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005； 2.浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325005)

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)屬于紅藻門(Rhodophyta)，紅藻綱(Rhodophyceae)，紅毛菜目(Bangiales)，紅毛菜科(Bangiaceae)，法紫菜屬(Pyropia)[1]。主要棲息在潮間帶，是我國(guó)特有暖溫帶性種類，分布于浙江、福建和廣東三省沿海[2]。壇紫菜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)栽培海藻，其年產(chǎn)量約占全國(guó)紫菜年產(chǎn)量的75%[3]。壇紫菜養(yǎng)殖品種的最初來(lái)源是巖礁上的野生壇紫菜，盡管自20世紀(jì)60年代壇紫菜已實(shí)現(xiàn)了全人工栽培，但野生壇紫菜仍然是進(jìn)行優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆等特性選育和優(yōu)化的重要種質(zhì)來(lái)源[3-4]。豐富的遺傳多樣性是物種適應(yīng)復(fù)雜自然環(huán)境的內(nèi)在基礎(chǔ)，因此，研究野生壇紫菜的遺傳多樣性對(duì)壇紫菜的遺傳育種和種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義[4]。近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，污染、養(yǎng)殖、堤壩建設(shè)等人類活動(dòng)對(duì)潮間帶的生態(tài)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了重大影響[5]。壇紫菜作為生長(zhǎng)于潮間帶的主要大型海藻之一，其自然資源已面臨嚴(yán)重衰退。而有關(guān)野生壇紫菜遺傳多樣性的報(bào)道卻很少[4,6-10]，尤其近4年已未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，亟需對(duì)現(xiàn)存的壇紫菜野生群體進(jìn)行資源調(diào)查和遺傳多樣性分析，旨在加強(qiáng)對(duì)自然資源的保護(hù)，以及為人工繁育選擇原始種質(zhì)資源提供參考。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)具有靈敏度高、效率高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好等特點(diǎn)[11]。作為最有效的分子標(biāo)記之一，AFLP已被廣泛應(yīng)用在藻類的種質(zhì)鑒定[12-13]、遺傳多樣性分析[14-16]、連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域[17-18]。因此，本研究運(yùn)用AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)采自浙江、福建和廣東三省沿海的6個(gè)壇紫菜野生群體進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果從分子水平揭示了我國(guó)東南沿海壇紫菜野生群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀，對(duì)壇紫菜種質(zhì)資源的評(píng)估和保護(hù)具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

壇紫菜分別隨機(jī)采集于浙江溫州竹嶼(ZY)、浙江臺(tái)州大陳島(DC)、福建平潭島(PT)、福建莆田南日島(NR)、福建寧德北礵島(BS)和廣東汕頭平嶼(PY)(表1)，共83株葉狀體樣品，陰干后帶回實(shí)驗(yàn)室，存放于-20 ℃冰箱備用。

表1 野生壇紫菜樣品信息

1.2 基因組DNA的提取

用毛刷將保存的壇紫菜樣品在超純水中刷洗干凈，按照“DN14-植物基因組DNA快速提取試劑盒”(北京艾德萊生物科技有限公司，DN1401)的操作說(shuō)明提取壇紫菜基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后，利用微量分光光度計(jì)(Nano-400)測(cè)定DNA的質(zhì)量與濃度，將DNA濃度調(diào)至30 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AFLP分析

AFLP分析流程參照Vos等[19]和王志勇等[20]的方法。實(shí)驗(yàn)所用的內(nèi)切酶(EcoRⅠ和MseⅠ)和T4 DNA連接酶為Fermentas公司生產(chǎn)；接頭和引物由英濰捷基(上海)公司合成，序列見(jiàn)表2。毛細(xì)管電泳檢測(cè)由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2 AFLP引物與接頭序列

酶切體系：模板DNA(30 ng·μL-1)5 μL，EcoRⅠ(10 U·μL-1)0.1 μL，MseⅠ(10 U·μL-1)0.1 μL，10×Tango Buffer 4 μL，滅菌純凈水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃酶切4 h，接著65 ℃酶切4 h，80 ℃滅活20 min。

連接體系：酶切產(chǎn)物5 μL，T4連接酶0.5 μL，10×T4 Buffer 1 μL，50% PEG4000 1 μL，EcoRⅠ接頭(5 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ接頭(50 μmol·L-1)0.5 μL，滅菌純凈水補(bǔ)齊至10 μL，22 ℃連接1 h，70 ℃滅活5 min。

預(yù)擴(kuò)增：連接產(chǎn)物1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2 μL，EcoRⅠ預(yù)擴(kuò)增引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.4 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；進(jìn)行20個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃延伸10 min。

選擇擴(kuò)增：預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍作為選擇性擴(kuò)增模板。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋液2 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2 μL，EcoRⅠ引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.4 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；以每個(gè)循環(huán)降1 ℃的梯度從65 ℃退火到56 ℃退火(94 ℃變性30 s，65 ℃～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；然后進(jìn)行27個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃延伸10 min。從64對(duì)選擇性引物組合中篩選出樣品可以全部擴(kuò)出、多態(tài)性高的8對(duì)引物組合進(jìn)行群體選擇性擴(kuò)增。

電泳檢測(cè)：選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳。用ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems, USA)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因分型，用GeneMapper Software 5 進(jìn)行等位基因大小分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果選取片段大小在0～500 bp的片段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，構(gòu)建“0 1”矩陣，運(yùn)用GenAIEx 6.51b2[21-22]計(jì)算種群內(nèi)有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，以及進(jìn)行ANOVA分析和二維主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis，PCoA)。根據(jù)Nei’s遺傳距離，使用軟件MEGA 7.0構(gòu)建UPGMA聚類圖。觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、種群間遺傳分化系數(shù)(Gst)、種群間基因流動(dòng)系數(shù)(Nm)由PopGen 3.2軟件計(jì)算完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增多態(tài)性

用篩選出的8對(duì)選擇性引物對(duì)6個(gè)壇紫菜群體的83個(gè)樣品進(jìn)行AFLP分析，共得到1 261個(gè)有效位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)1 260個(gè)。不同引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為141～188個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出157.63個(gè)AFLP位點(diǎn)。擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物對(duì)是E-AGG/M-CAA。每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)位點(diǎn)比例均大于99%(表3)。

表3 AFLP選擇性引物的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物對(duì)復(fù)雜環(huán)境適應(yīng)能力的一種反應(yīng)，是評(píng)價(jià)生物資源狀況的重要依據(jù)。由表4可知，6個(gè)壇紫菜群體的多態(tài)位點(diǎn)比例(PPL)為91.18%～98.89%，平均96.63%；Na為1.410 0～1.637 6，平均1.504 5；有效等位基因數(shù)(Ne)為1.189 0～1.243 0，平均1.225 4；I為0.186 3～0.244 4，平均0.222 8；H為0.118 9～0.152 9，平均0.141 7；無(wú)偏多樣性(uh)為0.129 7～0.166 8，平均0.153 4。其中DC群體的多樣性最豐富，NR群體的多樣性水平最低。

表4 6個(gè)壇紫菜群體的遺傳多樣性參數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

6個(gè)壇紫菜群體間Gst為0.248 0，表明遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)，Nm為1.519 6，表明不同地理群體的壇紫菜間存在一定的基因交流。ANOVA分析顯示(表5)，21.77%的變異來(lái)自群體間，78.23%的變異來(lái)自群體內(nèi)，6個(gè)群體間的差異顯著。這與Gst=0.248 0的結(jié)果基本一致。

表5 基于壇紫菜AFLP數(shù)據(jù)的分子方差分析(ANOVA)

2.4 遺傳距離與聚類分析

6個(gè)壇紫菜群體間的遺傳相似性系數(shù)為0.898 8～0.970 6，遺傳距離為0.029 9～0.106 7，DC與ZY群體的遺傳相似系數(shù)最大(0.970 6)，遺傳距離最小(0.029 9)，說(shuō)明這2個(gè)群體間的親緣關(guān)系最近，遺傳差異性最小。PY與NR群體的遺傳相似系數(shù)最小(0.898 8)，遺傳距離最大(0.106 7)，說(shuō)明這2個(gè)群體的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，差異性最大(表6)。

根據(jù)遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類樹(shù)并進(jìn)行個(gè)體主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)。群體聚類顯示：6個(gè)群體聚為2大類，ZY和DC群體、PY和PT群體先分別聚為兩小支，再匯合為一大支，然后與BS群體聚在一起，而NR群體則單獨(dú)為一大支(圖1)。這一結(jié)果在PCoA數(shù)據(jù)中也得到了展示，從圖2中可以看出DC和ZY群體之間，PY、PT和BS群體之間存在一定程度的基因混雜，而NR群體與其他群體間則出現(xiàn)明顯分離。

表6 壇紫菜野生群體間Nei’s遺傳距離(左下角和遺傳相似性系數(shù)(右上角)

圖1 壇紫菜6個(gè)群體的UPGMA聚類分析

圖2 83個(gè)壇紫菜樣品的主坐標(biāo)分析

3 討論

3.1 AFLP標(biāo)記檢測(cè)效果評(píng)價(jià)

AFLP標(biāo)記是多態(tài)條帶比例高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，不受基因組來(lái)源和復(fù)雜程度影響的標(biāo)記，可以用于檢測(cè)親緣關(guān)系非常近的材料之間的差異[23-24]。Hu等[25]利用AFLP和SSR分析比較蓮(NelumbonuciferaGaertn)的遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，AFLP標(biāo)記在評(píng)估遺傳分化及親緣關(guān)系時(shí)比SSR更為準(zhǔn)確，Liu等[11]利用AFLP技術(shù)揭示了中國(guó)沿海鼠尾藻的南北遺傳斷裂，表明AFLP技術(shù)用于群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析是可靠的。本研究利用AFLP技術(shù)對(duì)東南沿海壇紫菜野生群體進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)位點(diǎn)比例都大于99%，可見(jiàn)運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)壇紫菜進(jìn)行遺傳多樣性研究十分有效。

3.2 野生壇紫菜的遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種或群體經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化所積累的遺傳變異的總和[26]，能夠在一定程度上反映生物對(duì)復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)能力[27]，對(duì)該生物的可持續(xù)發(fā)展、保護(hù)和利用有著重要意義[28]。近年來(lái)，受人類活動(dòng)影響，富營(yíng)養(yǎng)化、污染、水動(dòng)力條件紊亂等對(duì)潮間帶的生態(tài)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了諸多影響[29]。壇紫菜是生長(zhǎng)于潮間帶的主要大型海藻之一，生境的變化勢(shì)必會(huì)對(duì)其自然資源造成嚴(yán)重影響，近幾年我們?cè)诤^(qū)采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)竹嶼(ZY)的野生壇紫菜已沒(méi)有每年都長(zhǎng)出，所以亟需重新評(píng)估壇紫菜野生群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀。由于野生壇紫菜主要附著于巖礁上采樣難度較高，有關(guān)野生壇紫菜種群遺傳多樣性的研究近幾年已未見(jiàn)報(bào)道，以往的研究采樣范圍較小，僅局限于某個(gè)省內(nèi)[4,6-10]。本研究采用8對(duì)AFLP選擇性引物對(duì)采自浙江、福建和廣東三省沿海的6個(gè)壇紫菜野生群體共83個(gè)樣本進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示6個(gè)群體的多態(tài)位點(diǎn)百分率為91.18%～98.89%，平均96.63%，雖然6個(gè)群體的遺傳多樣性不同，但多態(tài)位點(diǎn)百分率都在90%以上，這一結(jié)果與楊銳等[6]、陳奕欣等[30]和王鑫等[31]用AFLP技術(shù)對(duì)紫菜進(jìn)行遺傳多樣性分析得出的多態(tài)位點(diǎn)百分率相似。本研究得到的I為0.222 8，H為0.141 7，均低于陳昌生等[7]、紀(jì)德華[8]和Bi等[4]對(duì)福建野生壇紫菜和王金丹等[10]對(duì)浙南野生壇紫菜進(jìn)行遺傳多樣性分析得到的結(jié)果，雖未達(dá)到顯著差異，但仍表明目前野生壇紫菜的遺傳多樣性已經(jīng)有所下降。6個(gè)壇紫菜野生群體的uh為0.129 7～0.166 8，按無(wú)偏多樣性來(lái)排序，6個(gè)群體的遺傳多樣性順序?yàn)椋篋C群體>PT群體>BS群體>ZY群體>PY群體>NR群體，各個(gè)群體間的遺傳多樣性差異不顯著，并未表現(xiàn)出與地理位置的關(guān)聯(lián)。

3.3 壇紫菜野生群體間的基因交流

基因流動(dòng)程度會(huì)對(duì)群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響，當(dāng)種群基因流Nm大于1時(shí)，說(shuō)明群體間有一定程度的基因流動(dòng)，若Nm小于1，則說(shuō)明群體間分化明顯[26]。本研究壇紫菜群體間的Nm為1.5196，說(shuō)明這6個(gè)群體間存在一定的基因交流，由于大部分壇紫菜為雌雄同體，生殖方式主要是有性生殖，在其生活史中果孢子和殼孢子可以隨海流運(yùn)動(dòng)進(jìn)行傳播，這給不同地理群體間的壇紫菜發(fā)生基因交流提供了條件[7]。另外，中國(guó)沿海同時(shí)存在南向和北向2種主要的洋流模式，使壇紫菜果孢子和殼孢子大范圍的漂移成為可能，而東南沿海江河眾多，大量淡水沖入大海勢(shì)必對(duì)鹽度、泥沙含量、渾濁度、營(yíng)養(yǎng)鹽等與壇紫菜生長(zhǎng)相關(guān)的因素造成影響，進(jìn)而影響野生壇紫菜的自然分布。陳昌生等[7]利用ISSR對(duì)福建野生壇紫菜進(jìn)行分析得出Nm為7.193 0，紀(jì)德華[8]利用SRAP對(duì)福建野生壇紫菜進(jìn)行分析得出Nm為3.612 4，王金丹等[10]對(duì)浙南野生壇紫菜進(jìn)行分析得到Nm為2.359 1，Bi等[4]利用SSR分析福建的野生壇紫菜得出Nm為2.542。與之前的數(shù)據(jù)相比目前壇紫菜野生群體間的基因交流減少，分化程度逐漸加大。推測(cè)這可能是造成野生壇紫菜遺傳多樣性降低的原因之一。ANOVA分析得出壇紫菜有21.77%的變異來(lái)自群體間，78.23%的變異來(lái)自群體內(nèi)，來(lái)自群體間的變異大于陳昌生等[7]、紀(jì)德華[8]和Bi等[4]得到的結(jié)果，也表明野生群體間的分化正在加大。在UPGMA聚類圖中NR群體單獨(dú)聚為一類，而PCoA結(jié)果更清楚地顯示出NR群體已與其他地理群體明顯分開(kāi)，分化明顯。目前，尚不清楚出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因，南日島周圍眾多的小島嶼可能成為了阻礙壇紫菜果孢子和殼孢子隨洋流運(yùn)動(dòng)的地理障礙，造成南日群體與其他群體的分化逐漸加大。

4 小結(jié)

綜上所述，我們利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)出我國(guó)東南沿海野生壇紫菜的遺傳多樣性呈下降趨勢(shì)，個(gè)別島嶼的種群已有衰退跡象，因此，需要加大對(duì)壇紫菜野生資源的保護(hù)，搶救式采集野生壇紫菜進(jìn)行保種。另外，不同地理位置的壇紫菜野生群體間的基因交流減少，分化情況較之前更為明顯。本研究的數(shù)據(jù)有力補(bǔ)充了東南沿海地區(qū)野生壇紫菜的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)信息，為及時(shí)了解野生壇紫菜資源現(xiàn)狀，制定資源保護(hù)及開(kāi)發(fā)利用方案提供了理論支持。