何欣，柳愛春，劉超，白俊慧，虞軼俊，趙蕓*，丁明

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 實驗中心，浙江 杭州 310024； 2.浙江省耕地質(zhì)量與肥料管理總站，浙江 杭州 310020;3.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400)

喹諾酮類藥物是一類比較新的合成抗菌藥，抗菌譜廣，抗菌力強(qiáng)，口服吸收好，組織濃度高，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性，不良反應(yīng)相對較少，現(xiàn)已經(jīng)成為治療細(xì)菌感染性疾病的主要藥物，在臨床治療和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。然而，近些年的研究表明，喹諾酮類藥物除了會引起胃腸道反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、軟骨毒性、心臟毒性等方面的不良反應(yīng)外[1-4]，還有生態(tài)毒性。我國有超過半數(shù)的喹諾酮類抗生素被用在畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖中，動物與水生生物體內(nèi)抗生素的蓄積易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，進(jìn)而可能影響到人類健康[5]。同時，抗生素在生物體內(nèi)的利用度較低，絕大多數(shù)抗生素藥物最終會進(jìn)入到環(huán)境中，殘留在環(huán)境中的喹諾酮類抗生素一旦進(jìn)入水體，就有可能對水環(huán)境中的非靶生物及生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響[6-8]。

關(guān)于抗生素在水體中的含量檢測方法已有一些報道，包括快速檢測試劑盒、酶聯(lián)免疫檢測、毛細(xì)管電泳分析和液相分析等。其中，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因具有高準(zhǔn)確度和高靈敏度而成為目前主要應(yīng)用的化學(xué)分析技術(shù)[9-12]。本研究建立了一種可對水中15種喹諾酮類藥物進(jìn)行快速檢測的方法。該方法有助于加深對水體本底中抗生素含量和種類變化的了解，明確抗生素在環(huán)境中的遷移信息和防范風(fēng)險，同時，相關(guān)研究的結(jié)果還可為相關(guān)部門制定規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)：Waters Xevo TQ-S，配電噴霧離子源(ESI)，Waters公司；高速離心機(jī)，Bioridge公司。氮吹儀，Organomation公司。

甲醇，色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司。甲酸，色譜純，ROE Scientific公司。乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司。15種喹諾酮類藥物(氟甲喹、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、麻保沙星、氟羅沙星、加替沙星、沙拉沙星、司帕沙星、雙氟沙星)標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95%，DR公司。

固相萃取小柱：60 mg/3 mL，Waters公司；微孔有機(jī)濾膜，0.22 μm。

另配制NaH2PO4、Na2HPO4物質(zhì)的量之比為9∶1的0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液。

1.2 樣品制備與前處理

將1 L混勻的水樣，經(jīng)布氏漏斗過濾后，收集濾出液，重復(fù)收集一次，合并濾液，過0.22 μm水相濾膜，準(zhǔn)確量取500 mL備用。

準(zhǔn)確量取500 mL水樣于1 000 mL引流設(shè)備中，加入50 mL 0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液，用玻棒混勻2 min，室溫下避光引入3 mL的固相萃取柱上，固相萃取柱先以5 mL甲醇活化，用5 mL超純水洗滌。水樣以1 mL·min-1左右的流速經(jīng)過固相萃取柱后，加入3 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇洗滌，用6 mL甲醇洗脫。洗脫液在40 ℃下氮?dú)獯蹈珊?，用流動相定容?.5 mL，渦旋30 s后轉(zhuǎn)移至2 mL高速離心管，15 000 r·min-1離心10 min，過0.22 μm濾膜，濾液上機(jī)待用。

1.3 色/質(zhì)譜條件優(yōu)化

1.3.1 質(zhì)譜條件

采用直接注射方式進(jìn)樣，對15種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 μg·mL-1)分別在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜采集，獲得15種喹諾酮類藥物的母離子信息。通過改變碰撞能量，確定1～2個特征碎片，作為藥物對應(yīng)的子離子。同時，優(yōu)化錐孔電壓等參數(shù)，使得目標(biāo)物的信號最強(qiáng)，確定檢測目標(biāo)物的定量離子對、定性離子對、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)。

1.3.2 色譜條件

比較 ACQUITY BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY BEH Hilic(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY BEH amide(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)和ACQUITY HSS T3(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱作為分離材料的效果。在以下條件先進(jìn)行藥物的分離。流動相A，水；流動相B，100%乙腈。程序：0～1 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)95%～90%，流動相B體積分?jǐn)?shù)5%～10%；1～5.5 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)90%～10%，流動相B體積分?jǐn)?shù)10%～90%；5.5～6 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)10%～90%，流動相B體積分?jǐn)?shù)90%～10%；6～7 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)90%～95%，流動相B體積分?jǐn)?shù)10%～5%。選取峰形和響應(yīng)值均較好的色譜柱，優(yōu)化流動相條件，優(yōu)化時間梯度。

1.4 前處理方法優(yōu)化

比較極性HLB固相萃取柱、混合型陰離子交換柱(MAX)和混合型陽離子交換柱(MCX)凈化材料的吸附能力，比較甲醇和乙腈的洗脫效果，并對比pH分別為5.8、6.4和7.8時對提取樣品中15種目標(biāo)物進(jìn)行分析的效果。

1.5 方法學(xué)驗證和應(yīng)用

方法準(zhǔn)確度采用空白樣品加標(biāo)試驗確定。對水樣進(jìn)行3個水平的加標(biāo)回收試驗(n=6)?？瞻讟悠分?，分別以不同藥物響應(yīng)信號與噪音比為3倍和10倍定為檢出限(LOD)與定量限(LOQ)，各藥物的加標(biāo)水平分別為LOQ、10×LOQ和100×LOQ，各藥物加標(biāo)水平設(shè)置為1.0～100 ng·L-1。對水樣進(jìn)行重復(fù)測定(n=6)，計算各藥物平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，并將建立的方法應(yīng)用于杭州市水體9個斷面中采樣所得的樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜檢測參數(shù)

采用直接注射方式進(jìn)樣，對15種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg·mL-1)分別在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜采集。結(jié)果顯示，15種喹諾酮類藥物具有較高的靈敏度，且主要以[M+H]+分子離子形式存在。每個分析物母離子選擇2～4個信噪比(S/N)較高的子離子，優(yōu)化錐孔電壓，碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)(表1)。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱選擇

比較了4種色譜柱的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的洗脫條件下，各目標(biāo)物在T3和Hilic色譜柱上分離度較差，在C18和amide上各藥物均有不錯的分離效果，但amide柱上信號較差，靈敏度比C18柱低。原因可能是：C18和Amide柱配基密度低，使得分析物能更容易地進(jìn)入填料的微孔結(jié)構(gòu)中，為極性和疏水性分子提供均衡的保留性能。綜合來看，選擇C18作為色譜柱。

2.2.2 流動相優(yōu)化

改變流動相，在水相中加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸后峰形和響應(yīng)度大大提高。這是因為，加入甲酸后改變了流動相的pH值，使得目標(biāo)物更容易吸附在色譜柱上，同時可使樣品在質(zhì)譜中的離子化程度大大提高，從而提升檢測的靈敏度。

表1 UPLC-MS/MS法測定喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)

注：加粗為定量離子對。

對洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品在水相為50%時已經(jīng)完全洗脫，故可將洗脫梯度修改為流動相A，0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液；流動相B，100%乙腈。程序修改為：0～1 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)95%～90%，流動相B體積分?jǐn)?shù)5%～10%；1～5.5 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)90%～50%，流動相B體積分?jǐn)?shù)10%～50%；5.5～6 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)50%～90%，流動相B體積分?jǐn)?shù)50%～10%；6～7 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)90%～95%，流動相B體積分?jǐn)?shù)10%～5%。流速0.4 μL·min-1。15種分析物的UPLC-MS/MS色譜圖如圖1所示，各目標(biāo)物均得到較好的保留和分離。

2.3 凈化效果評價

試驗發(fā)現(xiàn)，HLB固相萃取小柱對所有喹諾酮類藥物均有一定的吸附作用，而MAX和MCX小柱吸附能力較差。為此，本方法選用HLB柱作為凈化材料。

以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含各分析物100 ng·mL-1)作為監(jiān)測和評價對象，比較分析了純水和5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液的淋洗效果，以及甲醇和乙腈的洗脫效果。選擇5%的甲醇溶液可避免喹諾酮類藥物在淋洗環(huán)節(jié)被洗脫，但如采用純水進(jìn)行淋洗，則無法達(dá)到對雜質(zhì)的清除效果。經(jīng)比較，采用5%甲醇水溶液作為淋洗液，更有助于降低基質(zhì)效應(yīng)。

考查甲醇和乙腈溶液對目標(biāo)物的洗脫效果，結(jié)果表明：2種有機(jī)溶劑對各分析物均有良好的洗脫效果?？紤]到乙腈過強(qiáng)的洗脫能力可能會引入較多的雜質(zhì)并具有較大的毒性，因此,選擇甲醇作為洗脫劑。

圖1 優(yōu)化后的各組分液相色譜

比較體積分別為3、6、10 mL的甲醇溶液的洗脫效果，結(jié)果表明，當(dāng)采用6 mL的甲醇作為洗脫溶液時，回收率與10 mL甲醇的洗脫回收率基本一致，可滿足定量分析要求。最終選擇的洗脫液為6 mL的甲醇溶液。

2.4 提取效果

喹諾酮類藥物分子極性較強(qiáng)，在不同的pH環(huán)境下，固相萃取柱對喹諾酮類藥物的吸附、洗脫效果差異較大。設(shè)置不同的pH條件，對提取樣品中15種目標(biāo)分析物的效果進(jìn)行比較。采用0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH，當(dāng)NaH2PO4和Na2HPO4的物質(zhì)的量之比分別為9∶1、1∶1和1∶9時，溶液pH值分別為5.8、6.4和7.8。向500 mL的過濾液中加入50 mL的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行提取和富集。結(jié)果表明：在酸性環(huán)境下，即NaH2PO4和Na2HPO4的物質(zhì)的量之比為9∶1時，喹諾酮類藥物的提取富集效果較好，此時的溶液pH值約為5.8，會給萃取過程提供酸性環(huán)境，使得喹諾酮類藥物更易富集在固相萃取柱上。

2.5 方法學(xué)驗證及應(yīng)用

試驗結(jié)果表明，在100 ng·L-1的加標(biāo)質(zhì)量濃度下，上述方法的總體加標(biāo)回收率為50.41%～111.64%，RSD為1.12%～14.26%，可滿足方法的準(zhǔn)確度要求。

試驗對水樣進(jìn)行了3個水平的加標(biāo)回收試驗(n=6)。對于水樣空白基質(zhì)，各抗生素的加標(biāo)水平分別為各自定量限LOQ、10×LOQ和100×LOQ，各藥物加標(biāo)水平分別設(shè)置為1.0、10.0、100 ng·L-1。水樣樣品的加標(biāo)回收率為50.41%～111.64%，RSD為1.12%～14.26%，方法精密度可滿足相關(guān)技術(shù)要求。

本方法為外標(biāo)法定量。在確定的最佳條件下，按各分析物的響應(yīng)值，將15種喹諾酮類藥物配制成含1.0～100 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，做工作曲線。結(jié)果表明，本方法下各分析物濃度與質(zhì)譜響應(yīng)值的線性關(guān)系良好，其決定系數(shù)(R2)均大于0.990；各藥物的最低LOD為1.0 ng·L-1，LOQ為1.0 ng·L-1(表3)。

將建立的方法應(yīng)用于27個水樣中，其中陽性樣品4個，陽性率為14.81%。其中，檢測出的喹諾酮類藥物種類有麻保沙星、恩諾沙星和氧氟沙星。

表2 喹諾酮類藥物加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=6)

表3 喹諾酮類藥物的線性關(guān)系、方法檢出限和定量限

3 小結(jié)

本研究建立了一種可對水中15種喹諾酮類藥物進(jìn)行快速檢測的方法。水樣經(jīng)過濾、提取，在HLB固相萃取柱上濃縮1 000倍，凈化，UPLC-MS/MS檢測，樣品的回收率為50.41%～111.64%，RSD為1.12%～14.26%，檢出限和定量限為1.0 ng·L-1。將建立的方法應(yīng)用于水樣中，檢測出陽性樣品4個，陽性率為14.81%，其中，檢測出的喹諾酮類藥物種類有麻保沙星、恩諾沙星和氧氟沙星。