曲麗君，張見(jiàn)，邢軍，李欣屹

(天津天豐澤田生物科技有限公司，天津 300457)

抽薹是植物從葉叢中抽出花薹的現(xiàn)象，是植株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期，是植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成的特性[1-2]。由于植物物種及其產(chǎn)品器官的多樣性，對(duì)于食用花莖、花蕾和角果的作物來(lái)說(shuō)，適當(dāng)促進(jìn)抽薹開(kāi)花是重要的。而對(duì)于以變態(tài)根和變態(tài)莖為產(chǎn)品器官的作物來(lái)說(shuō)，抽薹會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品器官品質(zhì)下降。蘿卜是世界上重要的蔬菜作物，其產(chǎn)品器官為肉質(zhì)根，不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有較高的藥用價(jià)值。蘿卜先期抽薹指肉質(zhì)根在完全膨大之前就已抽薹開(kāi)花[3]。先期抽薹導(dǎo)致植株進(jìn)入花芽分化狀態(tài)，肉質(zhì)根膨大基本停止，且隨著花芽分化、抽薹和開(kāi)花，肉質(zhì)根由致密變?yōu)槭杷桑焚|(zhì)快速下降, 失去商品價(jià)值[4]。

關(guān)于抽薹性狀的遺傳規(guī)律在甘藍(lán)、青花菜、大白菜等十字花科蔬菜中已取得重要進(jìn)展。Kagawa[5]對(duì)大白菜的研究認(rèn)為，早抽薹對(duì)晚抽薹為顯性。Baggett等[6]研究青花菜和甘藍(lán)的雜交組合，發(fā)現(xiàn)抽薹是數(shù)量性狀遺傳。張韜[7]認(rèn)為，抽薹性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，但是早抽薹性狀對(duì)晚抽薹性狀并不是完全顯性，易受環(huán)境的影響且遺傳效力較低。一些控制甘藍(lán)和大白菜抽薹性狀的QTLs位點(diǎn)被挖掘。陳書(shū)霞等[8]利用F2群體構(gòu)建了甘藍(lán)類(lèi)RAPD標(biāo)記遺傳圖譜，并定位了同抽薹期相關(guān)的3個(gè)QTLs，分別位于第1、3和8號(hào)連鎖群上。李梅[9]以結(jié)球甘藍(lán)品種間雜交獲得的F2群體作為構(gòu)圖群體，構(gòu)建了甘藍(lán)分子遺傳圖譜，并對(duì)結(jié)球甘藍(lán)抽薹時(shí)間性狀進(jìn)行QTLs定位，最終獲得1個(gè)與抽薹時(shí)間相關(guān)的QTL，可解釋18.7%的表型變異。Kitamoto等[10]在經(jīng)過(guò)春化的大白菜F2群體中將控制抽薹時(shí)間的QTLs定位于2、3和5號(hào)連鎖群，其中位于2號(hào)連鎖群的QTL對(duì)抽薹性狀的貢獻(xiàn)率達(dá)到46.0%，解釋的表型變異最大。目前關(guān)于蘿卜抽薹性狀遺傳規(guī)律的報(bào)道較少。Kaneko等[11]在蘿卜異源染色單體中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)早抽薹基因，它對(duì)于控制栽培種晚抽薹性狀的幾個(gè)基因均為顯性。趙麗萍[4]利用主基因與多基因混合遺傳模型聯(lián)合分析方法對(duì)蘿卜抽薹性狀進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)蘿卜抽薹性狀符合兩對(duì)主基因+多基因遺傳模型。這與其他十字花科蔬菜抽薹性狀的遺傳規(guī)律基本一致。

本研究中以早抽薹材料YS105和晚抽薹材料ZP85為親本構(gòu)建F2群體，同時(shí)借助SSR多態(tài)性標(biāo)記構(gòu)建的蘿卜分子遺傳圖譜，進(jìn)行蘿卜抽薹時(shí)間的QTLs定位及分析，可為培育耐抽薹蘿卜新品種及分子輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以蘿卜野生材料YS105為母本，栽培型材料ZP85為父本配制F1，F(xiàn)1嚴(yán)格自交獲得F2群體。其中YS105為早抽薹材料，ZP85為晚抽薹材料。F2群體大小為342株。采取常規(guī)方法進(jìn)行栽培管理。

1.2 抽薹性狀調(diào)查及分級(jí)

自播種至花薹伸長(zhǎng)至3～5 cm所需的天數(shù)作為抽薹時(shí)間。對(duì)親本、F1和F2群體分單株進(jìn)行連續(xù)調(diào)查并記錄抽薹時(shí)間，直至栽培型材料ZP85肉質(zhì)根成熟終止調(diào)查(播種后75 d)。根據(jù)各單株抽薹所需天數(shù)參照以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其抽薹性進(jìn)行分級(jí)：1級(jí)，抽薹天數(shù)≤45 d；2級(jí)，45 d<抽薹天數(shù)≤55 d；3級(jí)，55 d<抽薹天數(shù)≤65 d；4級(jí)，65 d<抽薹天數(shù)≤75 d；5級(jí)，抽薹天數(shù)>75 d。

1.3 DNA提取和分子標(biāo)記

DNA的提取采用改良的CTAB法[12]。其中親本和F1的DNA用于多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選，F(xiàn)2群體的DNA用于構(gòu)建遺傳圖譜和QTL定位。

本文所用的SSR分子標(biāo)記來(lái)源于蘿卜基因組序列，根據(jù)蘿卜EST序列設(shè)計(jì)的SSR引物[13]以及參照 Hashida 等[14]。PCR反應(yīng)體系15 μL：2 μL DNA(40 ng·μL-1)，正向、反向引物(10 ng·μL-1)各0.25 μL，Taq酶 0.2 μL(2.5 U·μL-1)，dNTP 0.2 μL，Mg2+1.2 μL(25 mmol·L-1)，10×Taqbuffer 1.5 μL，ddH2O 9.4 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠，160 V恒功率電泳分離1 h，銀染顯色后在膠片觀察燈下進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)分析。SSR引物序列由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.4 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用親本篩選多態(tài)性SSR分子標(biāo)記對(duì)F2群體DNA進(jìn)行分析。按照J(rèn)oinMap 4.0軟件[15]要求的方法統(tǒng)計(jì)條帶：與父本YS105一致的帶型記為a，與母本ZP85一致的帶型記為b，雜合的帶型記為h，未擴(kuò)增出的或模糊不清的帶型記為u。采用JoinMap 4.0軟件作圖，利用Kosambi作圖將重組交換率轉(zhuǎn)化為centi-Morgans (cM)[16]。

1.5 QTLs定位

利用MapQTL4.0軟件[17]進(jìn)行QTLs分析，首先利用置換測(cè)驗(yàn)1 000 次重復(fù)，根據(jù)“Permutation test”進(jìn)行全基因組掃描，估算基因組范圍內(nèi)α=0.05水平上的LOD閾值。然后，利用區(qū)間作圖法(interval mapping，IM)進(jìn)行QTL分析，得到大于LOD閾值的QTL位點(diǎn)。對(duì)于IM分析得到的QTL，將最高LOD 值所在位置的標(biāo)記或與其緊密連鎖的標(biāo)記作為協(xié)同因子，再對(duì)IM檢測(cè)到的QTL進(jìn)行多座位QTL模型(MQM)檢測(cè)，作為最終的定位結(jié)果。以連鎖群上LOD值最高的位置作為QTL的位置，同時(shí)分析每個(gè)QTL對(duì)蘿卜抽薹性狀的遺傳參數(shù)和貢獻(xiàn)率。QTL的命名規(guī)則如下：斜體字母“q”+性狀的英文縮寫(xiě)+連鎖群號(hào)+QTL編號(hào)[18]。如qbt-1-1即表示位于第1連鎖群上第一個(gè)與抽薹時(shí)間(bolting time，bt) 相關(guān)的QTL。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

利用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)雙親、F1及F2群體各單株的抽薹級(jí)數(shù)的調(diào)查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并獲得其表型變異及分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜抽薹時(shí)間的表型變異

通過(guò)對(duì)植株抽薹時(shí)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)母本YS105的平均抽薹時(shí)間為42 d，抽薹分級(jí)為1級(jí)，而父本ZP85在調(diào)查結(jié)束時(shí)(75 d)均沒(méi)有植株發(fā)生抽薹，抽薹分級(jí)為5級(jí)。F1的平均抽薹時(shí)間為68 d，抽薹分級(jí)為4級(jí)，介于雙親之間。F2群體在調(diào)查結(jié)束時(shí)有119株仍沒(méi)有發(fā)生抽薹，抽薹分級(jí)為5級(jí)，其他224株植株的抽薹時(shí)間變化幅度為32～75 d, 抽薹分級(jí)為1～4級(jí)(圖1)。由此可見(jiàn)，蘿卜抽薹時(shí)間性狀在F2群體中的分布基本介于雙親之間，少部分植株在該性狀中出現(xiàn)了超親分離現(xiàn)象。

圖1 蘿卜F2群體抽薹時(shí)間分級(jí)的分布

2.2 SSR 遺傳圖譜構(gòu)建

利用親本和F1篩選到的114對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)包含342個(gè)單株的F2群體進(jìn)行鑒定。利用JoinMap 4.0[17]建立了包含9個(gè)連鎖群的蘿卜遺傳圖譜。該圖譜覆蓋基因組長(zhǎng)度894.9 cM，平均標(biāo)記間距為7.85 cM。連鎖群的長(zhǎng)度在50.8～155.4 cM。每個(gè)連鎖群的標(biāo)記數(shù)在6～20，其中LG1和LG4包含的標(biāo)記數(shù)最多，為20個(gè)，LG5和LG9含有的標(biāo)記數(shù)最少，僅有5個(gè)(圖2)。

圖2 蘿卜抽薹時(shí)間遺傳圖譜及QTL定位

2.3 抽薹時(shí)間性狀的QTLs定位

經(jīng)“Permutation test”對(duì)全基因組掃描，估算“Rel.cum.count”為0.950 0時(shí)的Interval值為3.3，即設(shè)定當(dāng)LOD值≥3.3時(shí)存在QTL。利用區(qū)間作圖法并結(jié)合多座位QTL模型(MQM)檢測(cè)，共檢測(cè)到4個(gè)與蘿卜抽薹時(shí)間相關(guān)的QTLs，分布于LG 5、LG 6、LG 8和LG 9上，分別命名為qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1 (圖2、表1)。LOD值介于10.18～18.11，可解釋8.4%～21.6%的表型變異率。

qbt-5-1的LOD值為10.18，介于標(biāo)記RSS2108～RS5-3，貢獻(xiàn)率為8.4%，加性效應(yīng)為0.47，顯性效應(yīng)為0.20；qbt-6-1位于89_21540～89_21637，其LOD值為18.11，可解釋14.7%的表性變異率，其加性效應(yīng)為0.67，顯性效應(yīng)為-0.48；qbt-8-1介于41_14295～RS8-2，LOD值為16.69，可解釋21.6%的表型變異率，該位點(diǎn)的加性效應(yīng)為0.81，顯性效應(yīng)為0.06；qbt-9-1位于標(biāo)記9ssr-10～9ssr-14，LOD值為11.57，貢獻(xiàn)率為10.7%，加性效應(yīng)為0.57，顯性效應(yīng)為0.13。

表1 蘿卜抽薹時(shí)間QTLs定位及效應(yīng)分析

3 討論

蘿卜抽薹性狀為主基因和多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán)境條件影響，人為難以控制，且早抽薹對(duì)晚抽薹為不完全顯性，因此，給選育耐抽薹品種及新種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)帶來(lái)較大困難[4,11]。分子圖譜構(gòu)建及QTLs定位可加速分子標(biāo)記輔助育種的進(jìn)程。本研究利用 F2群體對(duì)控制蘿卜抽薹時(shí)間性狀的QTLs進(jìn)行定位及效應(yīng)分析，最終得到與蘿卜抽薹時(shí)間相關(guān)的4個(gè)QTLs位點(diǎn)(qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1)，分別位于蘿卜第5、6、8和9連鎖群上。它們的遺傳貢獻(xiàn)率分別為8.4%、14.7%、21.6%和10.7%，加性效應(yīng)分別為0.47、0.67、0.81和0.57，顯性效應(yīng)分別為0.20、-0.48、0.06和0.13。這4個(gè)位點(diǎn)均為增效位點(diǎn)，可在低世代育種中快速選擇純合的優(yōu)良性狀。qbt-8-1貢獻(xiàn)率達(dá)到21.6%，可能是控制蘿卜抽薹時(shí)間的主效位點(diǎn)。

一些與抽薹性狀相關(guān)的連鎖標(biāo)記的開(kāi)發(fā)利用可大大加速耐抽薹品種的改良進(jìn)程。Ajisaka等[19]利用BSA策略獲得了一個(gè)與大白菜極晚抽薹性狀緊密連鎖的RAPD標(biāo)記RA1255C，并成功轉(zhuǎn)化為共顯性RFLP標(biāo)記，該QTL可解釋77%的表型變異，為晚抽薹的分子標(biāo)記輔助選擇奠定了重要基礎(chǔ)。目前對(duì)蘿卜抽薹分子標(biāo)記的研究還相對(duì)較少，存在遺傳距離較大，尚不能較好地用于分子標(biāo)記輔助育種的問(wèn)題。趙麗萍[4]采用BSA與GRA策略，對(duì)抽薹性狀進(jìn)行多種遺傳標(biāo)記分析，獲得可能與抽薹性主效位點(diǎn)緊密連鎖的8個(gè)標(biāo)記。徐文玲等[20]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合BSA法，獲得2個(gè)與蘿卜耐抽薹基因連鎖的標(biāo)記，其遺傳距離分別為14.6和9.1 cM。在本文中，我們將3個(gè)QTLs位點(diǎn)(qbt-5-1、qbt-6-1和qbt-9-1)的遺傳距離控制在11.1 cM以?xún)?nèi)，下一步將繼續(xù)在該區(qū)域附近設(shè)計(jì)引物進(jìn)行加密，將蘿卜抽薹性的基因控制在更小的距離范圍內(nèi)，力求獲得與蘿卜抽薹性更為連鎖的分子標(biāo)記，用于蘿卜耐抽薹品種選育過(guò)程。