段 漣，葛 頌

(遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 牙周科，貴州 遵義 563099)

牙周炎(Periodontitis)是由菌斑生物膜中的微生物所引起的慢性感染性疾病，隨著年齡的增長，患病率增高。成年人牙周炎在我國的患病率為50%～ 60%，是導致牙齒脫落的首要原因[1]。胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)是Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)發(fā)病機理的樞紐，是胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性降低的狀態(tài)。目前研究表明，外周炎癥和IR存在著密切的聯(lián)系[2]。當炎癥反應(yīng)發(fā)生時，機體能分泌多種炎癥因子使胰島素信號被阻斷從而誘發(fā)IR[3]。如牙周炎組織中的細菌及其代謝產(chǎn)物刺激組織內(nèi)免疫細胞釋放的炎癥介質(zhì)白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)能通過多種途徑抑制胰島素信號傳導，降低胰島素敏感性，引起IR[4]。另一方面牙周炎也可以導致全身亞臨床炎癥狀態(tài)，而炎癥對糖代謝的影響則可能進一步影響胰島β細胞的功能，從而誘發(fā)IR。阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種慢性的大腦退行性疾病，其神經(jīng)病理學最重要的特征之一是神經(jīng)炎癥，可能是由于局部中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵犯或外周感染引起[5]，因此有學者提出牙周炎可能作為全身炎癥分子的重要來源加重AD[6]。也有研究表明，腦內(nèi)IR是AD的一個病理特征，且海馬內(nèi)胰島素信號通路失調(diào)會導致認知功能障礙[7]。然而，IR在牙周炎和AD之間的因果關(guān)系尚未得到證實?；诖?，本研究旨在分析實驗性牙周炎通過調(diào)節(jié)全身IR對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的影響，初步探討牙周炎對AD發(fā)生發(fā)展的可能影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡雄性 SD大鼠40 只，SPF 級，體重(180～200g)，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學實驗動物中心普通動物房，飼養(yǎng)環(huán)境清潔安靜，室溫 22℃，濕度(50±5)%，12h晝夜光照交替循環(huán)，飼養(yǎng)房內(nèi)定期進行紫外線消毒，每周兩次更換墊料，定期對飼養(yǎng)籠具和飲水瓶消毒，自由飲食飲水。

1.1.2 牙周特異性致病菌 活化保存菌種牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)ATCC33277，用BHI血瓊脂固體培養(yǎng)基復活，厭氧環(huán)境培養(yǎng) 2～5 d，挑取平板上單個菌落加入到新鮮配制的PBS緩沖液中，制備細菌懸液，并用紫外分光光度計調(diào)節(jié)濃度為OD(600)1.0左右，即細菌濃度為1×108CFU/mL，加入0.1g羧甲基纖維素配制成含2%羧甲基纖維素的新鮮菌液備用。高脂飼料購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011，高脂飼料成分比例：普料59%、豬油18%、白糖20%、蛋黃3%。

1.1.3 主要試劑與儀器 無菌 5-0 縫合絲線購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司；2.0正畸結(jié)扎絲購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；大鼠胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；胰島素抗體購自Proteintech公司；TNF-α抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；血糖儀及血糖試紙條購自三諾生物傳感股份有限公司。Centrifuge5417R低溫超速離心機購自德國Eppendorf公司；EG1150 石蠟包埋機購自德國Leica公司；RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機購自德國Leica公司；TKY-TKA攤片烤片機購自湖北泰康公司；BX43正置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，40只大鼠隨機分為空白對照(C)、胰島素抵抗(IR)、單純牙周炎(P)和胰島素抵抗復合牙周炎(IR-P)4組，C、P組接受普通飼料喂養(yǎng)，IR、IR-P組接受高脂飼料喂養(yǎng)12周。高脂飼料于第2周開始喂養(yǎng)，牙周炎模型于第5周開始建立，總共持續(xù)8周。實驗前大鼠禁食12 h，以2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，在結(jié)扎絲上用無菌縫合絲線打結(jié)，然后將結(jié)扎絲對準雙側(cè)上頜第二磨牙環(huán)繞牙頸部結(jié)扎，并將絲線結(jié)留在頰腭側(cè)誘導牙周炎。P、IR-P組結(jié)扎后，按每只大鼠每天20 mg的劑量，將氨芐青霉素磨碎后放入飲水中口服，共3 d，然后停藥1 d，以不含抗生素的水喂養(yǎng)，去除口腔內(nèi)的殘留藥物，以備接種細菌。停藥1 d后開始隔日接種P.gingivalis(每周3次)，每只大鼠雙側(cè)上頜第二磨牙周圍涂抹含P.gingivalis的羧甲基纖維素，使其布滿上頜第二磨牙牙頸部，C、IR組大鼠第二磨牙周圍涂抹2%羧甲基纖維素。每周檢查結(jié)扎絲線1次，若脫落及時重新結(jié)扎。

1.2.2 檢測指標

1.2.2.1 牙周組織檢測 牙周結(jié)扎4周后，觀察大鼠口腔內(nèi)情況，并隨機處死一只單純牙周炎組大鼠行HE染色觀察牙周破壞情況，確定實驗性牙周炎模型的可靠性；13周后處死剩余大鼠，每組隨機抽3只大鼠行PBS及4%多聚甲醛透心灌注，石蠟切片，厚4μm，行牙周組織HE染色；剩余大鼠去除上頜骨周圍軟組織，修整頜骨，沖洗，用1%亞甲藍溶液染色數(shù)秒，立即用PBS沖洗多余染液，吹干。于體視顯微鏡下觀察牙槽骨吸收程度并拍照，設(shè)定1 mm為標尺，以標尺長度為參照標準，測量上頜第二磨牙頰腭側(cè)近中、中央、遠中6個位點釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂(Cemento-enamel junction to alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距離，6個位點測量值之和的均值為牙槽骨吸收量。

1.2.2.2 體重及空腹血糖的測定 每周測量每組大鼠體重；每兩周測量每組大鼠空腹血糖，空腹血糖的測定采用血糖儀對大鼠尾靜脈末梢血進行檢測。

1.2.2.3 大鼠血清空腹胰島素檢測及IR、胰島β細胞功能的評估 眼眶靜脈抽取全血2 mL，4℃過夜后3 000 rpm高速冷凍離心10 min，取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)，測定大鼠血清空腹胰島素濃度。采用HOMA(Homeostasis model assessment,HOMA)穩(wěn)態(tài)模型，根據(jù)空腹血糖及空腹胰島素指標計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA of insulin resistance,HOMA-IR)及胰島β細胞功能指數(shù)(HOMA of Beta-cell function,HOMA-β)，公式為HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mU/L)/22.5[8]，HOMA-β=20×空腹胰島素/(空腹血糖-3.5)%[9]。

1.2.2.4 大鼠胰腺形態(tài)學觀察 取大鼠胰腺組織蠟塊于切片機上切成厚度5 μm切片，進行HE染色及免疫組織化學染色，光學顯微鏡觀察胰島素及TNF-α在胰腺的表達情況，并拍照記錄，利用Image-ProPlus 6.0軟件測量分析每組大鼠胰島素陽性表達的平均光密度值。免疫組織化學染色應(yīng)用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2.5 腦組織尼氏染色 腦組織蠟塊冠狀面切成5 μm厚的切片，進行尼氏染色。光學顯微鏡觀察各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)及尼氏小體，拍照記錄，每張切片選擇3個不同視野拍攝，并對存活神經(jīng)元的數(shù)量進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 動物模型制備

2.1.1 實驗性牙周炎模型建立 P、IR-P組大鼠造模14d后開始出現(xiàn)上頜第二磨牙牙齦紅腫，食物殘渣堆積，于牙周結(jié)扎4周后即結(jié)扎中期隨機處死一只單純牙周炎組大鼠做牙周病理檢測，結(jié)果顯示上頜第二磨牙結(jié)合上皮稍向根方遷移，并有大量炎癥細胞浸潤(見圖1)。

右圖為左框放大圖。圖1 牙周結(jié)扎中期HE染色

13周后處死剩余大鼠，處死前可見上頜第二磨牙探診易出血，牙齒松動，牙周探及深牙周袋；C、IR組牙齦色澤正常，探診無出血。處死后行牙周病理檢測，HE染色鏡下觀察可見P、IR-P組上頜第二磨牙牙周組織膠原纖維束排列紊亂，結(jié)合上皮向根方退縮，牙周袋形成，溝內(nèi)上皮出現(xiàn)潰瘍，且部分溝內(nèi)上皮增生呈網(wǎng)眼狀，少量炎性滲出物移出至牙周袋內(nèi)，牙槽嵴頂降低；C、IR組牙齦上皮完整，表現(xiàn)為正常牙周組織(見圖2)。

左圖：牙槽骨HE染色代表圖；右圖：為左框放大圖。圖2 HE染色觀察各組大鼠牙周破壞程度

為了進一步觀察大鼠牙周組織破壞情況，本實驗又對所收集的牙槽骨進行亞甲藍染色及體視顯微掃描，觀察各組上頜第二磨牙牙槽骨的吸收程度，結(jié)果P、IR-P組上頜第二磨牙釉牙骨質(zhì)界(CEJ)到牙槽嵴頂(ABC)的線性距離骨質(zhì)丟失比C、IR組多(P<0.001)；IR組骨質(zhì)丟失與C組相似(P>0.05，見圖3)。HE染色結(jié)果與體視顯微鏡中牙槽骨吸收程度相一致，這些數(shù)據(jù)證實了牙周結(jié)扎加接種牙周病原菌誘導大鼠牙周炎的存在。

左圖：牙槽骨亞甲藍染色；右圖：大鼠牙槽骨丟失量；**：P<0.001；n=4。圖3 各組體視顯微鏡下觀察及統(tǒng)計結(jié)果

2.1.2 IR模型建立 對各時間段每組大鼠的體重、空腹血糖進行監(jiān)測，各組大鼠體重隨時間逐漸增長，實驗初始各組大鼠間體重對比無統(tǒng)計學意義，第7周IR組大鼠體重高于IR-P組(P<0.05)，且第8周IR組大鼠體重高于P組(P<0.05)，P、IR-P組大鼠結(jié)扎后體重減輕，但在第9周體重逐漸回升(見圖4A)；各組大鼠空腹血糖值均在正常范圍內(nèi)，各組間比較無差異(見圖4B)；P、IR、IR-P組空腹胰島素均大于C組(P<0.05，P<0.05，P<0.01)(見圖5A)。

采用HOMA-IR評估全身胰島素敏感性，值均較小，進一步取自然對數(shù)值代替。結(jié)果表明，IR、IR-P組HOMA-IR評分較C組明顯增高(P<0.05，P<0.01)，且IR-P組評分也高于P組(P<0.05，見圖5B)。HOMA-IR結(jié)果表明，高脂飲食能成功誘導IR模型。

A：體重監(jiān)測；B：空腹血糖監(jiān)測；與P、IR-P組相比，#：P<0.05 ；n=4。圖4 動態(tài)監(jiān)測大鼠體重和空腹血糖

A：空腹胰島素；B：HOMA-IR評分。與C組相比，#：P<0.05，*：P<0.01；與IR-P組相比，+：P<0.05； n=3-4。圖5 各組空腹胰島素及HOMA-IR評分結(jié)果

2.2 實驗性牙周炎對大鼠IR及胰島β細胞功能的影響 HOMA-IR評分結(jié)果顯示P組HOMA-IR評分高于C組(P<0.05)，且IR-P組HOMA-IR評分也高于IR組(P<0.05，見圖5B)。采用HOMA-β指數(shù)評價大鼠胰島β細胞功能，結(jié)果表明，與C組相比，P、IR、IR-P組HOMA-β評分均降低(P<0.01，P<0.001，P<0.001)，且IR-P組HOMA-β評分均低于P組(P<0.001)、IR組(P<0.05)，其中IR組HOMA-β評分也低于P組(P<0.01，見圖6)，與HOMA-IR結(jié)果共同說明實驗性牙周炎干預能加重大鼠IR程度，且該作用可能與胰島β細胞功能下調(diào)有關(guān)。

與C組相比，*：P<0.01，**：P<0.001；與IR-P組相比，+：P<0.05，+++：P<0.001；P組與IR組相比，#：P<0.01；n=3-4。圖6 各組HOMA-β變化結(jié)果

2.3 實驗性牙周炎對大鼠胰島組織形態(tài)及胰島β細胞分泌胰島素的影響 胰腺HE染色結(jié)果顯示，C組正常胰島散布于腺泡之間，與外分泌腺界限清晰，胰島細胞著色淺呈團索狀分布，P組與C組相似； IR、IR-P組胰島邊界不規(guī)則，外分泌腺伸入胰島內(nèi)，β細胞排列紊亂(見圖7)。為了進一步證實全身胰島素敏感性的變化，對胰腺組織進行了胰島素免疫組織化學染色(見圖8)，各組陽性表達強度不同。IR、IR-P組胰島明顯異常，不規(guī)則投射到外分泌組織，且IR-P組胰腺病理改變嚴重，有大的拉長和分裂的胰島，表明胰島增生。對胰島素陽性表達平均光密度值進行統(tǒng)計分析(見圖8)，IR、IR-P組陽性表達均高于C組(P<0.01，P<0.001)，且IR-P組陽性表達明顯高于P、IR組(P<0.001，P<0.01)，其中IR組陽性表達也高于P組(P<0.05)。

圖7 大鼠胰腺組織HE染色

2.4 胰島細胞TNF-α表達 通過免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)P、IR、IR-P組大鼠胰島細胞TNF-α呈強陽性表達，且僅在胰島著色，外分泌腺未見著色；與陰性對照相比，C組大鼠胰島細胞TNF-α呈弱陽性表達(見圖9)。

上圖：胰腺免疫組織化學染色；下圖：胰島素陽性表達平均光密度值統(tǒng)計圖。與IR-P組相比，*：P<0.01，**：P<0.001；與IR組相比，#：P<0.05，++：P<0.01 ；n=3。圖8 實驗性牙周炎對大鼠胰島β細胞分泌胰島素的影響

圖9 免疫組織化學染色各組胰島TNF-α表達情況

2.5 實驗性牙周炎和IR對大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量的影響 通過尼氏染色觀察神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量，C組大鼠神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，P、IR、IR-P組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的破壞，排列紊亂且松散，部分細胞出現(xiàn)深染和核固縮現(xiàn)象(見圖10)。對各組大鼠海馬組織CA3區(qū)神經(jīng)元進行量化分析發(fā)現(xiàn)，P、IR組大鼠神經(jīng)元數(shù)量少于C組，但差異無統(tǒng)計學意義。IR-P組神經(jīng)元數(shù)量較C、P、IR組明顯減少(P<0.001，P<0.01，P<0.01)，提示實驗性牙周炎和IR共同作用可破壞大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)并減少其數(shù)量(見圖10)。

上圖：尼氏染色代表圖；下圖：海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計圖。與IR-P組相比，*：P<0.01，**：P<0.001；n=3。圖10 實驗性牙周炎和IR對大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量的影響

3 討論

IR與炎癥的關(guān)系是近年來研究的熱點，有學者提出“炎癥學說”，認為炎癥是導致IR的主要分子機制[10]。Su等[11]研究發(fā)現(xiàn)牙周炎作為一種誘導因素引起炎癥的初始階段，并促進了肥胖大鼠模型IR的發(fā)展。而且胰島素信號通路與炎癥因子的信號傳導也存在交互作用[12]，即炎癥導致IR的主要分子機制是通過非特異性炎癥所產(chǎn)生的炎癥因子，如TNF-α、IL-6等干擾胰島素受體底物(Insulin receptor substrate,IRS)/磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/AKT)信號通路的傳導而造成。此外，在AD發(fā)病早期出現(xiàn)胰島素信號傳導異常，因而有學者將AD列為“III型糖尿病”[13]。胰島素信號通路負責神經(jīng)元的存活和記憶的形成，并且胰島素受體(Insulin receptor,INSR)和胰島素樣生長因子(IGF)大量存在于大腦中與記憶有關(guān)的腦區(qū)，如海馬、下丘腦和大腦皮層，因此腦內(nèi)胰島素作用的中斷會導致神經(jīng)元功能的損害[14]。

2019年Dominy等的研究證明，牙齦蛋白酶能介導P.gingivalis的毒性，而其抑制劑可能有助于治療P.gingivalis的腦定植和AD的神經(jīng)退行性變[15]。動物研究同樣發(fā)現(xiàn)，野生型C57BL/6小鼠長期口服P.gingivalis可導致大腦內(nèi)出現(xiàn)AD的病理征象，包括神經(jīng)炎癥、神經(jīng)退行性變、膠質(zhì)細胞增生以及淀粉樣斑塊的形成和神經(jīng)元纖維纏結(jié)[16]。牙周炎中的牙周致病菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素脂多糖激活巨噬細胞可產(chǎn)生大量的促炎因子，這些促炎因子直接干擾胰島素和受體結(jié)合后信號的傳導，從而阻斷胰島素的生物學作用，隨即發(fā)生IR[17]。

本研究通過高脂飲食建立IR大鼠模型，采用HOMA穩(wěn)態(tài)模型測定HOMA-IR指數(shù)，結(jié)果顯示P組HOMA-IR評分高于C組，且IR-P組也高于IR組，表明實驗性牙周炎可加重大鼠的IR程度。同時高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺發(fā)生病變，IR-P組胰島素陽性表達平均光密度值高于IR組，這可能是因為胰島素的利用效率降低導致胰島素濃度增多，從而加重胰島β細胞的負荷最終加速其功能的衰竭。實驗結(jié)果顯示牙周結(jié)扎8周后，IR-P組大鼠的HOMA-β評分低于IR組，提示實驗性牙周炎加重了IR模型大鼠胰島β細胞功能的下調(diào)。TNF-α是牙周感染和炎癥破壞過程中發(fā)揮重要作用的促炎細胞因子，本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在P、IR、IR-P組胰島細胞呈強陽性表達，可能是因為TNF-α在胰腺組織中僅存在于胰島細胞，且隨著實驗性牙周炎和IR的干預，HOMA-β指數(shù)呈逐漸降低趨勢而HOMA-IR評分則越來越高，說明TNF-α可能通過介導下調(diào)胰島β細胞功能從而加重大鼠IR，與臨床研究中TNF-α水平升高參與IR的病理過程結(jié)果同理[18]，但TNF-α是否直接參與IR，還是有其它炎癥因子協(xié)同參與這一過程，仍有待研究。大腦海馬神經(jīng)元丟失是AD的一個主要病理特征，且神經(jīng)元數(shù)量的減少會進一步引起或加重認知功能障礙。尼氏小體形態(tài)及數(shù)量的改變可間接反映神經(jīng)細胞的受損程度。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗性牙周炎和IR干預后，大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量較C組減少(差異無統(tǒng)計學意義)，與Li等[19]研究高脂飲食處理導致海馬CA3區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量減少結(jié)果一致。IR-P組大鼠海馬神經(jīng)元損傷程度較IR組更重，表明實驗性牙周炎的干預會造成IR模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷和丟失。

綜上所述，在IR存在情況下，實驗性牙周炎可下調(diào)胰島β細胞功能并加重大鼠的IR程度，從而引起大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷。雖然炎癥可能是導致肥胖相關(guān)海馬神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵病理機制之一[20]，并且根據(jù)之前的研究，我們也發(fā)現(xiàn)高脂飲食能引起促炎因子TNF-α的表達增加，然而高脂飲食、海馬神經(jīng)元功能和牙周炎之間的聯(lián)系機制還未完全了解，有待進一步的研究。