范敏慧 帥仁亞 王 俊

肺癌是最常見的惡性腫瘤，也是導致癌癥死亡的主要原因，占全世界新發(fā)癌癥病例的17%，在我國肺癌的發(fā)病率和致死率在各類腫瘤中居首位[1-2]。臨床上，肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占比85%[3]。目前肺癌的治療主要以放化療和手術治療為主，盡管近年來針對肺癌表皮生長因子受體（EGFR）突變的靶向藥物如吉非替尼等逐步進入臨床，然而靶向藥物費用高昂，且后期同樣存在耐藥情況，因此也驅動著新型藥物的研發(fā)[4-5]。臭椿酮是一種從中草藥臭椿中提取的類古芥酸[6]。研究表明，臭椿酮對體外許多癌癥細胞系，包括HepG2 細胞，Hep3B 細胞，R-HepG2 細胞，HeLa 細胞，Huh-7 細胞，SGC-7901 細胞和MCF-7 細胞等，具有明顯的抑制效果[7-9]。本課題探究臭椿酮對人非小細胞肺癌H460 細胞的增殖、遷移和侵襲作用，并進一步解析其中的分子機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人非小細胞肺癌H460 細胞株，購自美國ATCC 公司。H460 細胞于含1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Penici-llin-Streptomycin Solution，PSG）和10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中生長，并在5%CO2、37°C 下培養(yǎng)。

1.2 中藥單體 臭椿酮（Sigma-Aldrich，SML 2143-5MG）溶解于二甲基亞砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，D2650）中，配制成濃度為200μM 的母液，用時稀釋至相應的濃度。臭椿酮作用H460 細胞48h，用于后續(xù)試驗。

1.3 試 劑 CCK8 細胞增殖檢測試劑盒（批號00070716）、細胞核染料DAPI（批號0009536）購自上海碧云天生物技術有限公司；結晶紫染色試劑（006423265）購自北京索萊寶科技有限公司；96 孔細胞遷移測定試劑盒（批號2155631）、BME 細胞侵襲測定試劑盒（批號26205126）購自美國Cultrex 公司；Cyclin D1（細胞周期蛋白D1）兔單抗（批號54565482）購自abcam；磷酸化蛋白酪氨酸激酶Src（p-Src）兔單抗（批號2168121）、蛋白酪氨酸激酶Src（Src）兔單抗（批號210825）、磷酸化細胞蛋白激酶B（p-Akt）兔單抗（批號4060451）、細胞蛋白激酶B（Akt）兔單抗（批號254691） 購自美國CST 公司；Alexa Fluor Plus 555 山羊抗兔熒光二抗（批號11011-8613）購自美國Invitrogen 公司；actin 作為內參。

2 實驗方法

2.1 CCK8 法檢測細胞增殖 將H460 細胞以5000個細胞/孔的密度接種在96 孔板中。細胞增殖通過CCK8 試劑盒進行測定。藥物刺激后將CCK8 溶液添加到培養(yǎng)基中，并放于培養(yǎng)箱37℃孵育1h。使用M5酶標儀在450nm 處測量吸光度。

2.2 細胞遷移/侵襲 分別通過使用Cultrex 96 孔細胞遷移測定試劑盒和Cultrex BME 細胞侵襲測定試劑盒進行遷移和侵襲測定。將H460 細胞在無血清培養(yǎng)基中孵育24h，然后使用消化重懸于無血清培養(yǎng)基中。將具有10%FBS 的培養(yǎng)基添加至下室，并將細胞懸浮液（1×104個細胞）添加至上室。同時上室中加入1.0μM 的臭椿酮，然后在37℃下于5%CO2中孵育24h。最后，按照制造商的說明計算遷移和侵入的細胞。

2.3 Western blot 檢 測Cyclin D1、p-Akt、Akt、p-Src、Src 蛋白水平 藥物處理細胞48h 后收集蛋白，經過電泳轉膜后，5%BSA 封閉1h，過夜4℃孵育一抗（稀釋比均為1:1000），洗去一抗后孵育熒光二抗，利用Odyssey 熒光掃膜儀曝光。

2.4 細胞免疫熒光 第一天將細胞鋪于細胞爬片上，待細胞生長過夜后加入臭椿酮處理48h，取出細胞，利用4%多聚甲醛組織固定液進行固定處理，0.5% triton-PBS 透膜，5%山羊血清封閉，4℃孵育Cyclin D1 一抗（稀釋比1:200），次日洗去一抗后孵育熒光二抗（稀釋比1:400），最后利用DAPI 染細胞核。利用FV1000 共聚焦顯微鏡成像。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（） 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 臭椿酮對非小細胞肺癌H460 細胞增殖的影響CCK8 法檢測臭椿酮對非小細胞肺癌H460 增殖的作用，結果表明，與0μM 濃度比較，不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0μM）臭椿酮處理的H460 細胞增殖明顯受抑制（P＜0.05 或P＜0.01），見表1。

表1 不同濃度臭椿酮對H460 細胞增殖的影響（%，）

表1 不同濃度臭椿酮對H460 細胞增殖的影響（%，）

注：各組分別用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM 的臭椿酮處理H460 細胞；與0μM 組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

3.2 臭椿酮對非小細胞肺癌H460 細胞遷移/侵襲的影響 通過Cultrex 96 孔細胞遷移法和Cultrex BME 細胞侵襲法檢測臭椿酮對非小細胞肺癌H460細胞遷移/侵襲的作用（見圖1-2），臭椿酮處理條件下H460 細胞的遷移率和侵襲率明顯低于DMSO 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表2。

圖1 臭椿酮對H460 細胞遷移的作用（結晶紫染色，×40）

圖2 臭椿酮對H460 細胞侵襲的作用（結晶紫染色，×40）

表2 臭椿酮對H460 細胞遷移侵襲率的影響（%，）

表2 臭椿酮對H460 細胞遷移侵襲率的影響（%，）

注：DMSO 組為DMSO 處理H460 細胞；臭椿酮組為臭椿酮（1.0μM）處理H460 細胞；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.01

3.3 臭椿酮對Cyclin D1 表達的影響 利用細胞免疫熒光實驗檢測臭椿酮對H460 中Cyclin D1 表達的影響，結果顯示，臭椿酮處理條件下，Cyclin D1 陽性細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表3，圖3。

表3 臭椿酮對Cyclin D1 陽性率的影響（%，）

表3 臭椿酮對Cyclin D1 陽性率的影響（%，）

注：DMSO 組為DMSO 處理H460 細胞；臭椿酮組為臭椿酮（1.0μM）處理H460 細胞；DMSO 為二甲基亞砜；Cyclin D1 為細胞周期蛋白D1；與DMSO 組比較，aP＜0.01

圖3 臭椿酮對Cyclin D1 表達的影響（熒光染色，60×）

3.4 臭椿酮對Akt、Src 活化的影響 臭椿酮處理H460 細胞48h 后檢測細胞增殖遷移相關信號Akt、Src 磷酸化的變化，結果顯示，臭椿酮明顯抑制p-Akt、p-Src 的活化以及Cyclin D1 的表達，見圖4。

圖4 臭椿酮對Akt、Src 磷酸化的影響

4 討論

在多種癌癥中，如胃癌，前庭神經鞘瘤，人類早幼粒細胞白血病和前列腺癌中，臭椿酮具有抗腫瘤活性，具體抗腫瘤機制包括抑制細胞增殖、遷移和凋亡[6，10-12]。然而臭椿酮在肺癌，尤其是非小細胞肺癌中的相關研究仍有不足，特別是其抗腫瘤的分子機制。在本研究中，臭椿酮明顯抑制H460 細胞的增殖、遷移和侵襲（P＜0.05 或P＜0.01）。初步機制探究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮可通過抑制細胞周期相關蛋白Cyclin D1 的表達抑制H460 的增殖（P＜0.01）。此前有多項研究表明，促細胞增殖信號Src 激酶的激活可以調控Cyclin D1 的表達，從而影響細胞的增殖[12-14]。基于此，本研究結果顯示，Src 的磷酸化被明顯抑制。Akt 信號的激活對于肺癌細胞的遷移和侵襲至關重要[15-16]。因此本文也探究了細胞增殖侵襲相關信號Akt 的磷酸化，結果顯示Akt 的磷酸化明顯下降。綜上推測，臭椿酮可能是通過調控Src 的磷酸化從而抑制Cyclin D1介導的細胞增殖，同時通過抑制Akt 的磷酸化抑制細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，臭椿酮對非小細胞肺癌的作用機制可能是通過抑制Akt、Src 磷酸化的激活，從而抑制肺癌細胞的惡性進程。