魏興梅馮國棟陳龍云王曉喆高志強*

1中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院北京協和醫(yī)院耳鼻喉科（北京100730）

2中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院北京協和醫(yī)院病理科（北京100730）

對于中耳黏膜病變嚴重的患者，中耳術后鼓室粘連會造成鼓室含氣腔減小，從而影響中耳振動，導致聽力不佳[1,2]。有研究證明硅膠材料用于鼓室成形術中可有效防止鼓室粘連[3,4]，醫(yī)用硅膠材料理化性質穩(wěn)定，具有惰性、無毒性的特點，對人體組織反應小，并且可長久存在，耐老化，起到支撐和阻隔的作用[3-6]。目前醫(yī)用硅膠材料已廣泛用于醫(yī)療衛(wèi)生領域，包括可長期留置的人工肺、人工腦膜、乳房假體、鼻梁假體、人工心臟瓣膜、人工耳蝸電極等[7]，經多年臨床應用顯示產品性能穩(wěn)定。目前未見國內外專用于中耳手術防止粘連的硅膠產品，也未見其安全性、有效性的系列研究。另外由于中耳腔的特殊生理功能，其通過咽鼓管與外界相通，內耳圓窗膜的滲透作用等，硅膠材料的應用是否會導致感染或加重炎癥，甚至影響內耳功能，尚未見有研究報道。北京協和醫(yī)院設計并委托上海威寧整形制品有限公司（III類醫(yī)療器械生產資格證號：20000284）加工生產硅膠片。通過動物實驗驗證鼓室硅膠支撐片的安全性。由于豚鼠聽覺靈敏且與人類聽力水平相近，耳道寬、短、直，鼓膜面積較大[8]，便于手術操作，我們選用豚鼠為實驗動物，通過將硅膠片植入中耳腔觀察鼓膜、鼓室情況及鼓室黏膜炎癥和測試聽力情況以驗證該產品的安全性。本研究經過北京協和醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會批準（編號：XHDW-2019-006）。

1 方法

1.1 實驗動物與麻醉

使用豚鼠（雄性，12-14周，重約350g）為實驗動物，動物由北京維通利華實驗動物有限公司提供，動物數量為18只。使用異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，深圳，中國）吸入麻醉（誘導5%，流量5ml，維持1.5%，流量1ml）。

1.2 實驗材料

實驗所用的硅膠材料委托上海威寧整形制品有限公司加工生產，原材料皆來自于美國Nusil公司的MED-47系列，經精煉制膠，壓模成型加工制成。產品大小為10×10×1mm，動物實驗中根據需要裁剪至合適大小。

1.3 聽力測試方法

麻醉生效后，清理雙側耳道后測試雙耳聽力。使用 RZ6（BioSigRZ ，Tucker-Davis Technologies，USA）系統(tǒng)測試聽性腦干反應（Auditory Brainstem Response，ABR）并記錄。測試方法如下：使用針刺電極，記錄電極位于顱底正中，同側乳突部位為參考電極，對側乳突為負極，極間電阻＜5kΩ。通過聲場耳機位于測試側給聲，刺激聲為Click聲。自80dB SPL開始，以10dB遞減，接近閾值時以5dB遞減；能檢測到的反應最低水平即為反應閾值（圖1）。

圖1 聽性腦干反應測試結果示例。此例中30dB SPL為聽力閾值Fig.1 An example of recorded auditory brainstem response trace of a guinea pig.In this example,the hearing threshold is 30dB SPL.

1.4 手術過程

測完聽力后，選擇左側為實驗側。左耳向上，去除耳周毛發(fā)并進行耳周及耳道消毒，耳內鏡(Karl Storz,Tuttlingen,Germany)輔助下暴露鼓膜，于鼓膜后下象限制作穿孔，然后在相應的鼓岬黏膜使用尖針劃傷，面積約2×2mm，于劃傷部位放置硅膠片，使硅膠片覆蓋劃傷的黏膜（圖2）。同法將右側制作鼓膜穿孔，但不放置硅膠片。術后每天肌注抗生素（阿莫西林克拉維酸鉀12.5ml/kg，一天兩次）預防感染。4周后，全麻下再次觀察鼓膜像和進行ABR閾值測試，然后處死動物取出聽泡，觀察鼓室內情況（圖3）。

圖2 硅膠片置于劃傷的鼓岬黏膜表面Fig.2 The picture of silastic sheet put on the abraded mucosa of middle ear

圖3 豚鼠離體的聽泡標本。黑色箭頭所指為硅膠片Fig.3 The isolated tympanic bullas of a guinea pig.The arrow points to silastic sheet

1.5 病理情況

取出劃傷部位的黏膜及骨質固定于4%的福爾馬林中24h，然后進行脫鈣、石蠟包埋、切片和H&E染色。然后光鏡下對中耳黏膜根據炎性反應、纖維化程度和黏膜厚度進行分級和評分（圖4）。

圖4 中耳黏膜病理切片所見。A.炎性反應較輕的中耳黏膜示意，黏膜較薄。箭頭所指為炎性反應。H&E染色，放大10倍；B.炎性反應較重的中耳黏膜示意，黏膜較厚。箭頭所指為炎性反應。H&E染色，放大10倍。Fig.4 A.Example with mild inflammation of mucosa in middle ear.The mucosa is thinner.B.Example with severe inflammation of mucosa in middle ear.The mucosa is thicker.Arrow points to inflammation react.H&E stain,×10

1.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS 24.0(IBM,Armonk,NY)對數據進行統(tǒng)計學分析。使用配對T檢驗分別比較實驗側和對照側的術前術后聽力變化，獨立樣本T檢驗比較術前術后雙側聽力有無差異。使用卡方檢驗比較實驗組和對照組鼓膜、中耳情況和中耳黏膜的炎癥、纖維化和黏膜厚度的區(qū)別。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鼓膜和中耳黏膜情況

術后4周，耳內鏡下所見顯示實驗側有一只動物存在小穿孔，其余鼓膜皆完整（圖5）。取下聽泡后，打開鼓膜見實驗側和對照側各有一只存在少量鼓室積液（圖6），其余鼓室內皆無積液及異常滲出。所有標本皆未見化膿、感染及粘連的發(fā)生?？ǚ綑z驗顯示試驗組和對照組的鼓膜情況（χ2=1.029，P=1）和鼓室內情況（χ2=0,P=1）均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

圖5 術后4周所見鼓膜像。A.鼓膜愈合完整，箭頭所指為制作穿孔處；B.鼓膜未完全愈合的1例鼓膜像，見為邊緣性干穿孔。Fig.5 The tympanic membrane(TM)images four weeks after surgery.A.The TM was intact,and the arrow points to the place where the perforation was made.B.The one with a little perforation left.

圖6 存在中耳積液的樣本。A.鼓膜像可見鼓室內存在積液；B.打開聽泡見黏膜表面有滲出。Fig.6 The one with middle ear effusion.A.The tympanic membrane shows there was liquid in the middle ear.B.When the tympanic bulla was open, there was effusion on the mucosa.

2.2 聽力結果

實驗側術前平均聽力為27.22±6.00 dB SPL，術后平均聽力為30.28±5.55 dB SPL，對照側術前平均聽力為26.94±6.22 dB SPL，術后平均聽力為27.22±7.12 dB SPL。配對T檢驗顯示實驗側術前術后聽力無顯著性差異(T=0.102，P=1.355＞0.05)，對照側術前術后聽力無顯著性差異（T=0.193，P=0.920＞0.05）。獨立樣本T檢驗顯示術前兩組的聽力均無統(tǒng)計學差異(T=0.546，P=0.589＞0.05)，術后兩組的聽力均無統(tǒng)計學差異(T=-0.804，P=0.427＞0.05)。

2.3 病理結果

中耳黏膜的炎性反應、纖維化程度和黏膜厚度如表1所示?？ǚ綑z驗顯示兩者無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

中耳黏膜狀態(tài)是影響中耳手術聽力預后最重要的因素之一[9,10]，已有研究表明約10%的傳導性聽力下降是由粘連性中耳炎導致[11]。為了預防中耳粘連，曾有多種材料應用于臨床。例如曾有石蠟[12]、絲線[13]用于預防鼓室粘連，但由于易產生異物反應及影響聽力被廢用；后發(fā)展出的高分子塑料制品，由于太薄易被纖維組織機化而卷曲，并且異物反應比硅膠材料高，而逐漸被硅膠材料所取代[14]。后來使用的可吸收新型材料對于黏膜病變較輕的患者尚有一定作用，但對于黏膜病變嚴重的患者由于可吸收材料在短期內被吸收不能起到較長時間的阻隔作用而效果不佳[3,5]。所以硅膠材料由于其惰性、無毒性、不易卷曲且可長期起到阻隔作用而顯示出一定的優(yōu)勢，顯示出良好的應用前景[15,16]。臨床上常用的乳房假體、鼻梁假體手術已經證明本研究所用硅膠產品的原材料、加工生產及消毒工藝和環(huán)境同該公司生產的目前市場上所用的乳房、鼻梁假體等一致，已經臨床證實其安全性[17,18]。但由于中耳腔的特殊結構及傳聲的重要功能，其在中耳腔中的安全性研究未見報道，主要解決問題：1、由于中耳與外界相通的結構，異物的存在是否會導致感染或炎癥加重的機會增加？2、是否會導致內耳功能損傷？

本實驗統(tǒng)計學驗證兩組鼓膜愈合及中耳腔檢查并無統(tǒng)計學差異，顯示硅膠片沒有影響鼓膜愈合和中耳腔黏膜的恢復。聽力測試結果證明實驗側和對照側術前術后聽力均不存在差異，術后中耳黏膜炎性反應、纖維化程度和黏膜厚度兩組亦無差異，顯示硅膠片未影響聽力，未加重中耳黏膜的炎性反應，未造成內耳毒性。這一結果與大部分前期文獻報道結果相同。例如，1968年，Paparella等[14,19]報道在貓和松鼠猴的鼓室內植入硅膠材料并行鼓室成形術，經過2-4個月后觀察鼓室內情況，無明顯異物反應，且有助于鼓室含氣腔的形成；1992年，Ng和Linthicum等[19]對6具植入硅膠的尸頭進行研究，其最長植入時間可達21年，所有標本均有相對正常的中耳黏膜，均未見異物反應。術后兩組聽力未見差異，提示無內耳功能損傷。

但與有些學者報道的結果不同，例如黃德亮等[21]報道120耳粘連性中耳炎的治療療效，發(fā)現當時采用硅膠隔離物來預防粘連沒有達到理想的目標，部分病例出現了鼓膜穿孔、中耳感染，不得不經穿孔取出硅膠片才使炎癥反應得以控制?？紤]可能與當時所用硅膠的原材料及加工工藝有關。醫(yī)用硅膠加工過程中的物理、化學和生物性能需達到相關標準，并且通過試驗證明植入品對人體無毒、不會引起組織炎癥反應，副產物不會向重要器官遷移，材料未老化等方可臨床應用[22,23]。若使用質地不純或工業(yè)用有毒的硅酮類，可引起局部組織無菌性壞死；若清洗、滅菌不徹底，可造成異物反應，甚至植入時將指紋、棉紗纖維或粉塵帶入都有可能造成異物反應[24]。即使嚴格按照良好的生產方法進行加工，每批產品仍必須進行一系列的短期試驗，以確保植入物的無毒性和安全性，此外還必須消除可能引起的污染因素，因此需要有效的凈化室[24]。例如，與血液接觸的硅橡膠制品應在100級（每立方英尺空氣中0.3μm大小的雜質粒子不超過100個）的凈化室內進行加工，不植入體內的制品，通常是在10000級的凈化室內制作[25]。

本實驗結果有1例實驗側存在鼓膜小穿孔，穿孔為一干潔的穿孔，無感染征象，考慮穿孔是由于操作時靠近鼓膜邊緣，從而需要更多的時間愈合；實驗側和對照側各有一例發(fā)現鼓室內存在少量積液，存在積液的樣本病理也證實其炎癥反應較其他樣本更為嚴重，考慮積液可能是由于操作造成的創(chuàng)傷未完全愈合。

表1 炎性反應，纖維化程度和黏膜厚度的分級以及實驗側和對照側的比較。Table 1 The grading of inflammation,fibrosis and mucosal thickness as well as the comparison between test and control groups

改善硅膠片的性狀將有可能提高產品的性能。如2016年，Jang等[26]通過豚鼠動物實驗驗證加入地塞米松-海藻酸鈉的硅膠片較傳統(tǒng)硅膠片可減輕中耳黏膜炎癥反應，盡管尚未見相關產品上市，但毫無疑問，這是一個通過改進硅膠性狀和成分進而提升其治療效果的極有意義的探索。但是這一產品復雜的加工工藝和毒性驗證過程是應該考慮的。

本研究的局限性在于，由于目前尚無成熟可靠的中耳炎動物模型建立，與慢性中耳炎中耳腔植入硅膠片后的真實反應尚有差距。由于實驗動物良好的恢復能力，正常的咽鼓管功能，而且中耳腔內無慢性炎癥，可能使本項目研究結果要比實際情況更加樂觀，且無法驗證硅膠植入是否影響中耳腔細菌生物膜的形成和轉歸。另外本研究未進行硅膠材料是否會造成全身或局部細胞免疫反應以及細胞毒性反應的相關試驗，雖然其原料和加工工藝安全性已在其他假體材料中經過臨床驗證，但用于新的器官仍然需要重新驗證，今后將結合臨床數據進一步改進產品性能完善實驗。但本實驗亦提供了該產品對于鼓膜和中耳黏膜恢復，對聽力的影響和對中耳黏膜炎癥反應驗證的指標，結合本材料加工成的乳房假體、鼻梁假體在人體的應用，為其通過臨床試驗驗證有效性提供了依據。

4 結論

本研究所用硅膠鼓室支撐片置于損傷的中耳黏膜未產生明顯的異物反應，未影響鼓膜愈合及造成中耳感染，未產生內耳毒性及加重中耳黏膜炎性反應。