陳沛維趙春麗王丹妮楊勁松李潔趙守琴*

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院院耳鼻咽喉頭頸外科(北京100730)

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100038）

分泌性中耳炎（otitis media with effusion，OME），是兒童的常見病與多發(fā)病，是以中耳積液及聽力下降為主要特征的中耳非化膿性炎性疾病，是引起兒童聽力下降的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)大約90%的學(xué)齡前兒童患過OME。在美國，每年有兩千二百萬診斷為OME的患兒，每年造成的直接和間接損失估計達(dá)40億美元[1]。我國2004年流行病學(xué)調(diào)查示中國香港2-7歲患者OME發(fā)病率為5.2%-30.7%，與西方文獻(xiàn)報告無顯著性差異[2]。其高發(fā)病率及影響兒童聽力言語發(fā)育的特點使針對其發(fā)病機制及治療方法的研究具有重要意義。

目前OME公認(rèn)的發(fā)病機制包括咽鼓管阻塞及功能障礙，細(xì)菌及病毒感染等[3]。而近年大量研究表明免疫學(xué)機制從宏觀到微觀作用于分泌性中耳炎的發(fā)病過程，成為研究熱點及細(xì)胞因子治療、靶向治療的探索方向。

OME免疫學(xué)發(fā)病機制的研究不斷進(jìn)展，其基礎(chǔ)理論為“上下呼吸道炎癥一致性”學(xué)說：由于上、下呼吸道各部位在解剖學(xué)上是相連續(xù)的，炎癥很少只局限于某一部位。2004年首次驗證了在OME中耳積液、鼻咽部及上呼吸道具有相似免疫反應(yīng)[4]，并發(fā)現(xiàn)分泌性中耳炎與上氣道變態(tài)反應(yīng)性有著密切聯(lián)系[5]。而針對哮喘的研究發(fā)現(xiàn)輔助T細(xì)胞（helper T cell）亞群中Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)在哮喘發(fā)病中占主要地位[6]。研究由“上下呼吸道炎癥一致性學(xué)說”，進(jìn)一步向“Th1/Th2細(xì)胞失衡”延伸。Kariya S[7]等研究證實由多種細(xì)胞因子調(diào)控的Th1/Th2的失衡參與分泌性中耳炎的發(fā)病機制；趙守琴等[8,9]針對大鼠OME Th1/Th2細(xì)胞失衡模式的深入研究發(fā)現(xiàn)：多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的Th2/Th1細(xì)胞失衡模式是OME重要的免疫學(xué)發(fā)病機制之一。

隨著自身免疫性疾病及過敏性疾病研究的深入，近年來研究者發(fā)現(xiàn)除Th1/Th2細(xì)胞失衡外，還存在Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）針對多種疾病的調(diào)控。Th17細(xì)胞由CD4+T細(xì)胞分化而來，分泌IL-17等細(xì)胞因子，參與自身免疫性疾病、宿主防御反應(yīng)，具有很強的促炎癥作用。Treg細(xì)胞中以CD4+CD25+Treg細(xì)胞作為最具代表性，通過其特異性轉(zhuǎn)錄因子叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein 3,Foxp3)的調(diào)控IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）的分泌，發(fā)揮抑制抗原特異性免疫應(yīng)答，使機體產(chǎn)生免疫耐受的作用。突破經(jīng)典理論Th1/Th2細(xì)胞失衡的局限性，Th17/Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)機制成為多學(xué)科研究焦點，研究發(fā)現(xiàn)哮喘及過敏性鼻炎均存在外周血及局部黏膜Th17、Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子變化[10,11]。而針對OME中Th17和Treg細(xì)胞的初步研究發(fā)現(xiàn)中發(fā)現(xiàn)人OME中血清及中耳積液Th17特異性細(xì)胞因子IL-17升高[12]，成人OME患者外周血中Treg細(xì)胞的表達(dá)水平升高[13]。

本研究基于內(nèi)鏡、電鏡、組織學(xué)評估，成功建立免疫相關(guān)的OME模型；通過從細(xì)胞、分子、基因多個水平探究Th17/Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機制與OME的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

同批次SPF級健康雄性S-D大鼠20只。隨機分為對照組（20只，40耳），實驗組（20只，40耳）。全部動物經(jīng)耳窺鏡檢查證實無外耳道及中耳感染。

1.2 造模方法

實驗組參考Hardy SM造模方法[14,15]，實驗組大鼠于第1天以1.2mg卵清蛋白（OVA;A5503;Sigma Chemical Co）溶于 0.6ml磷酸鹽緩沖液(PBS）+5.14mg氫氧化鋁溶于0.6ml PBS作為免疫佐劑混勻后行腹腔注射。第8天重復(fù)注射一次，此為全身致敏階段。第15天用10%水合氯醛溶液0.35ml/100g經(jīng)腹腔注射麻醉后，將0.1mg OVA溶于35μl PBS混勻后，在顯微鏡下以微量注射器將其經(jīng)鼓膜后下或前下象限注入雙側(cè)中耳腔，第16天再次麻醉并重復(fù)鼓室注射一次，此為耳內(nèi)激發(fā)階段。對照組大鼠全身致敏階段以5.14mg氫氧化鋁溶于1.2 ml PBS腹腔注射，耳內(nèi)激發(fā)階段用35μl PBS替代OVA。其余操作同實驗組，于造模第18天內(nèi)鏡觀察局部中耳情況、確保建模成功，記錄分泌性中耳炎中耳變化。

1.3 外周血及中耳局部標(biāo)本采集

血樣標(biāo)本采集于建模第18天，麻醉后予心尖搏動處取血備用。取血完成后處死；顯微鏡下剝離聽泡，留取標(biāo)本固定處理后用于組織觀察，選取OME組及對照組各5只（10耳）鼓室黏膜樣本，保存于RNA later中（-80℃），用于中耳局部mRNA表達(dá)測定。

1.4 中耳組織學(xué)檢測

耳內(nèi)鏡下觀察記錄鼓膜像；聽泡標(biāo)本經(jīng)固定、脫鈣后行石蠟包埋切片、HE染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并記錄鼓室黏膜組織特點；聽泡標(biāo)本經(jīng)緩沖液固定、沖洗、漂洗后，經(jīng)梯度乙醇脫水，后轉(zhuǎn)入CO2臨界點干燥，離子濺射鍍金后，予以掃描電子顯微鏡下觀察。

1.5 外周血檢測

1.5.1 T細(xì)胞相關(guān)亞群測定

采用流式細(xì)胞法檢測血液中Th17及Treg的細(xì)胞比例。具體操作如下：EDTA抗凝全血經(jīng)紅細(xì)胞裂解后用1%FBS的PBS洗滌；取100l細(xì)胞懸液至流式管中，加入FITC標(biāo)記CD4抗體以及APC標(biāo)記CD25抗體，混勻后避光孵育20分鐘；加入2ml含1%FBS的PBS混勻細(xì)胞，300g離心5分鐘棄上清；加入FOXP3染色專用固定破膜液500l（1：4稀釋后），混勻后4度避光孵育30分鐘；300g離心5分鐘棄上清，加入破膜液2ml（1：10稀釋后），混勻后300g離心5分鐘棄上清；再次加入破膜液2ml（1：10稀釋后），混勻后300g離心5分鐘棄上清；加入PE標(biāo)記FOXP3抗體，混勻后4度避光孵育30分鐘；加入破膜液2ml，混勻后300g離心5分鐘棄上清；加入2ml含1%FBS的PBS混勻細(xì)胞，300g離心5分鐘棄上清；加入500l含1%FBS的PBS混勻細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀獲取分析。

1.5.2 細(xì)胞因子含量測定

以ELISA試劑盒(購自晶美生物工程有限公司)檢測中耳滲液中TGF-β、IL-17濃度。先以試劑盒所示的標(biāo)準(zhǔn)品原始濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在酶標(biāo)儀450 nm波長下測得各標(biāo)本的吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比得到對應(yīng)濃度，得出實際濃度。

1.6 鼓室黏膜相關(guān)基因表達(dá)測定方法

采用QPCR檢測鼓室黏膜FOXP3、RORγt的表達(dá)，具體操作如下：利用TRIzol?Reagent（Thermofisher公司），從組織中提取組織總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（promega公司），將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用qPCR SYBR?Green實時PCR系統(tǒng)，檢測FOXP3、RORγt的表達(dá)。將GAPDH表達(dá)作為內(nèi)參對照，內(nèi)參與靶基因的CT差異以-ΔCT表示。不同樣本ΔCT值之間的差異即為ΔΔCT，2ΔΔCT是ΔΔCT的2的指數(shù)值，表明了這兩組樣本之間基因表達(dá)的變化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。樣本量＞50用Kolmogorov-Smirnov檢驗(簡稱K-S檢驗)，樣本量＜50用Shapiro-Wilk檢驗。本實驗對照組與實驗組大鼠樣本量均＜50各自均采用Shapiro-Wilk檢驗。根據(jù)P值是否大于0.05確定是否為正態(tài)性，大于為正態(tài)性，小于為非正態(tài)性。符合正態(tài)分布采用獨立樣本t檢驗，不符合則采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 中耳內(nèi)鏡及組織學(xué)觀察

內(nèi)鏡下見對照組（圖1）鼓膜透明，鼓室內(nèi)未見明顯積液；實驗組（圖2）鼓膜橙色改變，渾濁、增厚，鼓室內(nèi)可見明顯積液。HE染色可見對照組鼓室纖毛黏膜上皮較薄，可見散在杯狀細(xì)胞分布，固有層無明顯炎性細(xì)胞浸潤；OME組黏膜層增厚，杯狀細(xì)胞增多且核深染，纖毛倒伏且部分缺失（圖3，4）。掃描電鏡觀察見對照組鼓室黏膜上皮纖毛覆蓋，中間散在分布少量杯狀細(xì)胞，纖毛排列整齊，未見明顯的纖毛缺失及倒伏（圖5）；OME組黏膜上皮間斷存在纖毛的明顯缺失、倒伏或聚集（圖6），以上驗證分泌性中耳炎建模成功。

圖1 對照組鼓膜Fig.1 Tympanic membrane of Control group

圖2 OME組鼓膜Fig.2 Tympanic membrane of OME group

圖3 正常鼓室黏膜上皮(HE染色)Fig.3 Tympanic mucosa epithelium of Control group（H&E stain）

圖4 OME鼓室黏膜上皮（HE染色）Fig.4 Tympanic mucosa epithelium of OME group（H&E stain）

圖5 對照組鼓室黏膜上皮（掃描電鏡1.5K倍）Fig.5 Tympanic mucosa epithelium of Control group（SEM 1.5K）

圖6 OME組鼓室黏膜上皮（掃描電鏡1.5K倍）Fig.6 Tympanic mucosa epithelium of OME group（SEM 1.5K）

2.2 外周血測試

2.2.1 外周血細(xì)胞檢測

OME組及對照組外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例分別為1.1755±0.84831及1.4095±1.12216（%），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖7）。OME組及對照組外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例分別為：5.969±1.548及5.615±1.704（%），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖8）。OME組及對照組Th17/Treg比值為0.1824±0.1198及0.2655±0.2166，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖9）。

圖7 OME組及對照組外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例（n1=n2=20）。采用秩和檢驗，Z=-0.054,P=0.957＞0.05。Fig.7 Percentage of peripheral blood Th17 cells in CD4+T cells of OME group and control group(n1=n2=20).Rank-sum test,Z=-0.054,P=0.957＞0.05.

圖8 OME組及對照組外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例（n1=n2=20）。采用獨立樣本t檢驗,t=0.689,P=0.495＞0.05。Fig.8 Proportion of peripheral blood Treg cells in CD4+T cells of OME group and control group(n1=n2=20).Independent sample t test,t=0.689,P=0.495＞0.05.

圖9 OME組及對照組外周血Th17/Treg細(xì)胞比例（n1=n2=20）。采用秩和檢驗,Z=-0.866,P=0.387＞0.05。Fig.9 The ratio of Th17/Treg cells in peripheral blood of OME group and control group(n1=n2=20).Rank-sum test，Z=-0.866,P=0.387＞0.05.

2.2.2 血清相關(guān)細(xì)胞因子檢測

實驗組及對照組血清TGF-β濃度分別為95.79±21.60及72.49±19.75（pg/ml）。OME組血清TGF-β較對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖10）。實驗組及對照組血清IL-17濃度測定分別為23.90±20.30及16.31±14.14（pg/ml），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖11）。

圖10 OME組及對照組血清TGF-β濃度（n1=n2=20）。采用獨立樣本t檢驗,t=3.084,P=0.005＜0.01,OME組血清TGF-β濃度較對照組增高。 *表示P＜0.05,**表示P＜0.01。Fig.10 Serum concentration of TGF-β in OME group and control group(n1=n2=20).Independent sample t test,t=3.084,P=0.005＜0.01,the serum concentration of TGF-β in OME group is higher than control group.*indicates P＜0.05,**indicates P＜0.01.

圖11 OME組及對照組血清IL-17濃度（n1=n2=20）。采用秩和檢驗，Z=-0.679,P=0.570＞0.05。Fig.11 Serum concentration of IL-17 in OME group and control group(n1=n2=20).Rank-sum test,Z=-0.679,P=0.570＞0.05.

2.3 中耳黏膜相關(guān)基因表達(dá)測定

通過PCR技術(shù)檢測中耳局部Foxp3 mRNA、RORγt mRNA表達(dá)情況（圖18，19，20），實驗組及對照組樣本量均為5只（10耳），結(jié)果顯示鼓室黏膜實驗組FOXP3 mRNA表達(dá)較正常對照組增高（P＜0.05）;RORγt mRNA表達(dá)OME組及實驗組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)（圖12，13）。

圖12 OME組及對照組鼓室黏膜FOXP3mRNA表達(dá)(n1=n2=5)。采用獨立樣本t檢驗，t=3.181，P=0.0036＜0.01，OME組鼓室黏膜FOXP3mRNA表達(dá)較對照組增高。*表示P＜0.05,**表示P＜0.01。Fig.12 Expression of FOXP3 mRNA in tympanic mucosa of OME group and control group(n1=n2=5).Independent sample t test,t=3.181,P=0.0036＜0.01，the expression of FOXP3 mRNA in tympanic mucosa in OME group is higher than control group.*indicates P＜0.05,**indicates P＜0.01.

圖13 OME組及對照組鼓室黏膜RORγt mRNA表達(dá)（n1=n2=5）。采用獨立樣本t檢驗,t=1.666，P=0.1069＞0.05。Fig.13 Expression of RORγt mRNA in tympanic mucosa of OME group and control group(n1=n2=5).Independent sample t test,t=1.666,P=0.1069＞0.05.

3 討論

OME的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，包括解剖因素，咽鼓管阻塞因素，病毒感染，免疫等，針對其免疫學(xué)發(fā)病機制的探索，從最初的“上下氣道一致性學(xué)說”進(jìn)一步發(fā)展到Th1/Th2細(xì)胞失衡模式，再到Th17、Treg細(xì)胞的細(xì)胞水平研究；在分子水平上初步發(fā)現(xiàn)IL-4、IFN-γ、IL-18、IL-17、TGF-β等多種細(xì)胞因子在OME發(fā)病機制中的作用；本研究針對OME中Th17/Treg發(fā)病機制進(jìn)一步探索。

3.1 細(xì)胞水平——Th17/Treg細(xì)胞失衡模式：中耳局部與全身

調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在自身免疫、過敏和癌癥中起著重要作用，目前對于CRS患者Th17/Treg狀態(tài)研究結(jié)果并不一致。Miljkovic等[16]檢測了鼻息肉、伴和不伴息肉的CRS鼻竇黏膜及正常鼻竇黏膜，發(fā)現(xiàn)鼻息肉的Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量升高，Tantilipikorn等[17]則發(fā)現(xiàn)伴鼻息肉的CRS鼻竇黏膜Treg細(xì)胞功能下降。大量的臨床研究及動物實驗表明變應(yīng)性鼻炎與OME有很大的相關(guān)性[18]，但當(dāng)前尚缺少分泌性中耳炎此免疫機制的研究，本研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg外周血變化實驗組及對照組無明顯差異，而中耳局部Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3基因表達(dá)在OME組中升高，提示Treg細(xì)胞與分泌性中耳炎免疫學(xué)機制密切相關(guān)，且Treg細(xì)胞在OME中耳局部免疫應(yīng)答中發(fā)揮更為重要的作用。

3.2 分子水平——TGF-β與IL-17的調(diào)節(jié)作用

本研究中實驗組血清TGF-β較對照組明顯升高，本課題組前期實驗已證明慢性SOM患者血漿中TGF-β含量高于正常人，中耳積液及外周血漿中TGF-β高表達(dá)[19]，而本實驗中變態(tài)反應(yīng)相關(guān)OME模型中OME組血清TGF-β升高，提示全身性免疫應(yīng)答也可能通過外周血漿的滲透提高中耳局部TGF-β的高表達(dá)。以上提示我們中耳的免疫機制可能是全身免疫與局部免疫反應(yīng)的共同作用,Treg細(xì)胞更傾向在中耳局部的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，其相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β可能共同參與全身及局部免疫應(yīng)答，發(fā)揮對Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。

研究表明人OME中血清及中耳積液IL-17升高，IL-17也是“雙刃劍”細(xì)胞因子的典型例子，IL-17是一種促炎細(xì)胞因子，可上調(diào)多種細(xì)胞因子和趨化因子，同時IL-17已被證明具有對多種微生物感染具有保護(hù)作用[20]，但本實驗中未檢測到實驗組及對照組中耳局部Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt的差異，可能因樣品中濃度低于檢測閾值所致，不排除可能與Th17在大鼠OME的免疫應(yīng)答中不發(fā)揮主要作用相關(guān)。

3.3 基因水平——Foxp3 mRNA、ROR-γt mRNA的表達(dá)及與TGF-β信號通路的相關(guān)性

研究表明TGF-β信號通路與中耳炎癥密切相關(guān)，通過調(diào)控信號通路中的基因位點可建立分泌性中耳炎模型[21]，已有研究表明中耳局部感染中Treg表現(xiàn)出的雙重作用，一方面中耳感染可早期誘發(fā)Treg的激活及擴增，可預(yù)防感染誘導(dǎo)的免疫病理，另一方面也可通過抑制保護(hù)性免疫反應(yīng)增加感染負(fù)荷，延長病原體的持久性。其與持續(xù)細(xì)菌感染的發(fā)病機制有關(guān)[6]。但中耳Treg的變化是否由單一感染機制誘發(fā)，本實驗結(jié)果顯示在非微生物接種模型中Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加，提示其也參與變態(tài)反應(yīng)誘發(fā)的OME。

淋巴細(xì)胞作為巡邏細(xì)胞在營養(yǎng)豐富的組織（如血液和淋巴結(jié)）和營養(yǎng)不良組織（如微生物感染組織以及癌癥相關(guān)組織）之間循環(huán)[22]，研究表明血清饑餓作為應(yīng)激源，其外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞增加，Treg細(xì)胞的分化和功能中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也顯著增加[23]。Fantini發(fā)現(xiàn)通過TGF-β信號通路，F(xiàn)OXP3基因表達(dá)上調(diào)[24]，可見TGF-β信號通路與FOXP3基因表達(dá)的相關(guān)性。本實驗中血清TGF-β及鼓室Foxp3表達(dá)均增加，提示在OME發(fā)病中可能存在類似機制，通過TGF-β信號通路，上調(diào)FOXP3基因表達(dá)水平，從而參與中耳局部免疫應(yīng)答，而OME中Treg水平增加及與TGF-β信號通路間的具體作用機制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，OME發(fā)病機制復(fù)雜，免疫因素可能為其發(fā)病機制之一。本研究通過建立變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的OME模型，發(fā)現(xiàn)OME的免疫相關(guān)發(fā)病機制之一可能是全身免疫反應(yīng)與局部免疫反應(yīng)的共同作用；CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞更傾向在中耳局部的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，而TGF-β可能參與OME全身及局部免疫應(yīng)答，并可能通過TGF-β信號通路發(fā)揮對FOXP3基因基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；Th17細(xì)胞在大鼠OME免疫機制中的作用有待進(jìn)一步研究。本研究旨在為OME的基礎(chǔ)研究和臨床防治提供新方法和重點方向，通過進(jìn)一步研究TGF-β信號通路及Foxp3 mRNA相關(guān)基因靶點，可為分泌性中耳炎提供新的治療思路。