朱婭，丁潔，王莉，王娟，汪洋

210011 南京，南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 腫瘤科

頭頸部癌占所有惡性腫瘤的6%，所有癌癥相關(guān)死亡中的2%[1]，全球發(fā)病率約為1/600 000[2]。據(jù)報道，吸煙與其發(fā)病有較高相關(guān)性，此外人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染，特別是HPV16,也是口咽部鱗癌的主要病因[3]。盡管手術(shù)、放化療和靶向治療已聯(lián)合用于這類患者，但近50%的患者最終死于原發(fā)疾病。近年來，免疫檢查點抑制劑成為了新的有效治療手段，在許多惡性腫瘤中取得了進展。免疫檢查點抑制劑能夠激活免疫系統(tǒng)，引導機體產(chǎn)生持續(xù)而有效的抗腫瘤免疫反應。頭頸部鱗癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)被認為是免疫缺陷腫瘤，它的發(fā)病與免疫逃逸機制有相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，HNSCC表面存在程序性死亡因子配體1(PD-L1/CD274)過度表達，特別在HPV(+)腫瘤中，由此引起PD-1/PD-L1通路上調(diào)，產(chǎn)生免疫抑制[4]。多項研究顯示，PD-1/PD-L1靶向抑制劑在晚期及轉(zhuǎn)移性頭頸部癌中取得了有效的治療效果[5-7]。

Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)是癌基因芯片及整合數(shù)據(jù)平臺，可用于查詢及分析惡性腫瘤基因的相關(guān)信息。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進行腫瘤及正常組織的差異基因分析，可尋找腫瘤標志物及治療靶點，指導腫瘤預后及靶向治療。本文從Oncomine數(shù)據(jù)庫中提取頭頸部癌PD-L1基因數(shù)據(jù)，比較了腫瘤組織及正常組織PD-L1的差異表達，并對亞組進行分析，同時結(jié)合高低表達的生存狀態(tài)，研究PD-L1的表達與預后之間的相關(guān)性，進一步指導靶向藥物的合理使用。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)提取

從Oncomine數(shù)據(jù)庫中提取頭頸部癌的PD-L1表達的mRNA數(shù)據(jù)，設(shè)定搜索條件：1)Gene：PD-L1(CD274); 2) Analyze type: Head and Neck Cancer, CancervsNormal; 3) 分析參數(shù)為P-value<0.05，F(xiàn)old change=1.5, Gene rank=top 10%; 4) 數(shù)據(jù)類型：mRNA。

1.2 統(tǒng)計學方法

頭頸部癌腫瘤組織和正常組織PD-L1基因表達差異采取t檢驗。PD-L1表達量的高低與預后的關(guān)系采用Log-rank檢驗(生存分析)，檢驗參數(shù)P=0.05，所有檢驗均采用Graphpad Prism 8.0.2軟件。

2 結(jié) 果

2.1 PD-L1在頭頸部癌的表達結(jié)果

PD-L1基因癌組織/正常組織表達量分析共176項，癌組織中高表達的共4類腫瘤，分別為：結(jié)直腸癌、頭頸部癌、肝癌及淋巴瘤。低表達的2類腫瘤，分別是食管癌和胰腺癌。在其余的14類腫瘤中均未有滿足條件的結(jié)果。在頭頸部癌中，滿足癌組織高表達的研究共1項(1/6)，無滿足要求的低表達研究；在離群值(Outlier)的13項研究中，共3項顯示高表達，2項顯示低表達(圖1)。整合頭頸部癌中PD-L1高表達的這6項研究(共10項分析)的結(jié)果顯示，PD-L1基因在頭頸部癌中的所有差異基因中排名第4 121位(P<0.05)，提示PD-L1在頭頸部癌中較正常組織呈高表達，去除2個關(guān)于甲狀腺癌的研究后，共包括242例樣本的8項分析，結(jié)果顯示PD-L1在其所有差異基因中排名為第4 374位(P<0.05)，提示在腫瘤組織中顯著高表達(圖2)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中PD-L1在多種腫瘤中的表達

Figure 1. PD-L1 Expression of Multiple Tumors in Oncomine Database

Red represents the number of high-expression studies of PD-L1 that meet the requirements. The darker the color, the higher the expression. Blue represents the number of studies with low expression of PD-L1. The darker the color, the lower the expression.

圖2 PD-L1在頭頸癌中的表達結(jié)果

Figure 2. PD-L1 Expression in Head and Neck Cancers

A.PD-L1 expression in 10 analyses of head and neck cancers; B. After removing 2 studies of thyroid cancer, PD-L1 expression in 8 analyses of head and neck cancer. The bars show the results of studies with high expression of PD-L1 (CD724). The darker the color, the higher the PD-L1 expression in the chip.

2.2 PD-L1在腫瘤組織與正常組織的表達差異

去除甲狀腺癌的2項分析后，在剩余 8項頭頸癌數(shù)據(jù)分析中，PD-L1表達的癌組織/正常組織差異(圖3)。

圖3 PD-L1在頭頸部癌組織與正常組織的表達

Figure 3. PD-L1 Expression of Tumor Tissue and Normal Tissue in Head and Neck Cancer

A. Peng et al; B. Sengupta et al; C. Pyeon et al; D. Ye et al.

2.3 PD-L1表達與HPV狀態(tài)的相關(guān)性

根據(jù)Oncomine數(shù)據(jù)庫對于臨床病理資料的分類結(jié)果，共83例樣本提供了HPV狀態(tài)。在HPV(+)的33例HNC患者中，PD-L1的平均表達量為0.38，在50例HPV(-)患者中，PD-L1的表達量為0.16，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018)(圖4A)。

圖4 PD-L1在不同分類腫瘤組織中的表達差異

Figure 4. PD-L1 Expression in Different Tumor Status

A.PD-L1 expression in different HPV status; B. PD-L1 expression in different M stages.

2.4 PD-L1表達與病理分級及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

在可獲得腫瘤病理分化程度的53例標本中，其中Grade 1～2級患者32例，Grade 3～4級患者21例，PD-L1在Grade 1～2級患者中的平均表達表達量為0.37，在Grade 3～4級患者中的表達量為0.34，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.836)?？色@知轉(zhuǎn)移情況的79例標本中，37例有遠處轉(zhuǎn)移，其PD-L1平均表達量為1.36， 42例無遠處轉(zhuǎn)移，PD-L1平均表達量為0.55，轉(zhuǎn)移組的PD-L1表達顯著高于非轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)(圖4B)。

2.5 PD-L1表達與生存的相關(guān)性

為了研究PD-L1表達量與預后的相關(guān)性，從Oncomine數(shù)據(jù)庫提取了80例標本，均可提供PD-L1基因表達數(shù)據(jù)、生存狀態(tài)及生存時間相關(guān)信息，包括口腔、口咽、下咽及舌鱗狀細胞癌4個癌種，男女比例為19∶1，中位年齡58.5歲，具體臨床信息見表1。分析后繪制出生存曲線，選取mRNA表達量中位數(shù)作為界值，其中高表達及低表達均為40例，中位生存時間分別為80個月及54個月。經(jīng)過log-rank檢驗后結(jié)果顯示PD-L1表達與預后無顯著相關(guān)性[PD-L1(+)/PD-L1(-)，HR:0.745，P=0.417]。我們再次用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)驗證HNSCC PD-L1mRNA表達與生存時間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達量與生存期仍然無顯著相關(guān)性(圖5)。

表1 80例頭頸部鱗癌患者臨床信息

Table 1. Clinical Information of the 80 Patients with Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

VariableOral cavity(n=10)Oropharynx(n=17)Hypopharynx(n=36)Tongue(n=17)Gender Male9(90.0%)16(94.1%)35(97.2%)16(94.1%) Female1(10.0%)1(5.9%)1(2.8%)1(5.9%)Age(year) ≥58.54(40.0%)7(41.2%)19(52.8%)11(64.7%) <58.56(60.0%)10(58.8%)17(47.2%)6(35.3%)PD-L1 expression High5(50.0%)10(58.8%)15(41.7%)10(58.8%) Low5(50.0%)7(41.2%)21(58.3%)7(41.2%)Median OS (M)90.077.034.563.0

OS: Overall survival; M: month.

圖5 PD-L1高表達和低表達的頭頸部癌患者生存差異

Figure 5. Survival Analysis of Patients with High and Low PD-L1 Expression of Head and Neck Cancer

A.No significant difference in survival between high and low PD-L1 expression with Oncomine database; B. No significant difference in survival between high and low PD-L1 expression with GEPIA database.

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計，美國2018年新發(fā)惡性腫瘤中，口腔及咽喉部癌約占3.7%，其中鱗狀細胞癌占90%以上，吸煙是致癌的第一誘因，HPV感染則是口咽部鱗癌的另一大誘因[8-9]。研究顯示，HPV感染能促進鱗癌的發(fā)生，HNSCC患者中HPV的感染率約57%～72%[10]。近年來，吸煙相關(guān)的頭頸部腫瘤呈下降趨勢，而HPV相關(guān)的頭頸部癌較前明顯增加，發(fā)病年齡提前[11-13]。

盡管采用放化療及靶向治療，2017年以前，對于復發(fā)轉(zhuǎn)移性的HNSCC，鉑類藥物進展后的治療方法僅限于單藥化療或化療聯(lián)合西妥昔單抗治療，患者中位生存時間不超過7個月[14-15]。多項研究發(fā)現(xiàn)HNSCC細胞表面存在PD-L1過表達，因此免疫檢查點抑制劑PD-1/PD-L1單克隆抗體在治療頭頸部癌中也成為了關(guān)鍵調(diào)節(jié)點。Ⅲ期多中心臨床研究CheckMate-141和KEYNOTE-040的研究結(jié)果顯示，免疫治療能夠改善一線治療后復發(fā)轉(zhuǎn)移的頭頸部癌的預后[6-7];KEYNOTE-040研究中，鉑類等化療進展后的HNSCC患者接受每3周200 mg劑量的Pembrolizumab治療，平均生存期可達到8.4個月，PD-L1高表達的患者甚至達到11.6個月的總生存期。同樣在CheckMate-141中，Nivolumab組較化療組表現(xiàn)出近3倍的生存優(yōu)勢。因此，美國FDA在2016年已經(jīng)批準最早的兩個PD-1單克隆抗體用于復發(fā)轉(zhuǎn)移性的HNSCC的二線及后續(xù)治療。目前國內(nèi)免疫治療在多種腫瘤中相繼開展，但價格昂貴，因此免疫治療前預測其治療效果具有一定必要性。

如何挑選免疫治療潛在有效的患者仍是臨床關(guān)注的重點問題。在Ib期臨床研究KEYNOTE-012中，對于復發(fā)轉(zhuǎn)移的HNSCC，HPV(+)患者的客觀緩解率為HPV(-)患者的近2倍(25%vs14%)[16]，并且在多項研究中均顯示一致結(jié)果[17-18]。既往研究也發(fā)現(xiàn)，HPV相關(guān)的HNSCC可能存在較為獨立的異常免疫過程，導致對于HPV感染的長期適應和宿主耐受[19-20]。本文分析顯示，HPV(+)患者腫瘤的PD-L1表達量較HPV陰性明顯增高，并具有顯著差異，這預示在PD-L1狀態(tài)不明的情況下，HPV狀態(tài)或可用來預測抗PD-1單克隆抗體的治療效果。分析還顯示PD-L1表達在遠處轉(zhuǎn)移的標本中較無遠處轉(zhuǎn)移者增高，具有顯著差異，提示PD-L1表達可能與腫瘤分期具有相關(guān)性，但這個結(jié)論仍需要通過全面的臨床分期及大樣本數(shù)據(jù)證實。

本文通過oncomine數(shù)據(jù)庫分析顯示，頭頸部惡性腫瘤的PD-L1表達較正常組織顯著增高，與既往研究報道相一致。生存分析顯示PD-L1表達量與預后不相關(guān)，并且該結(jié)果在GEPIA數(shù)據(jù)庫中得到驗證。既往有研究顯示，實體瘤中PD-L1表達與預后呈負相關(guān)，如食管癌、胃癌、泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤等[21]，同樣該結(jié)論在頭頸部腫瘤中也得到過驗證[22]。然而值得注意的是，作為PD-L1高表達或低表達的界定，至今無統(tǒng)一標準，絕大多數(shù)文獻中采用免疫組化法，使用腫瘤細胞陽性比例分數(shù)作為比較及界定標準。但由于免疫系統(tǒng)同樣表達PD-L1，聯(lián)合陽性分數(shù)有時也被作為參考標準。對于PD-L1 mRNA的檢測，有采用原位雜交技術(shù)，也有本文中數(shù)據(jù)庫采用的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)[23]。本文中的分析采用表達量的中位值作為界值，比較高表達與低表達各40例標本的PD-L1表達及總生存期無顯著差異，該結(jié)果也在GEPIA數(shù)據(jù)庫中得到驗證。

作為PD-L1受體的程序性死亡因子受體1基因通常在活化的B細胞、CD4+和CD8+T細胞，樹突狀細胞、自然殺傷細胞、抗原遞呈細胞及單核細胞中表達，既往研究顯示在HPV(+)的HNSCC中，PD-L1(+)的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)顯著增加[22-24]，該類人群對于抗PD-1免疫治療的反應率更高[25]。由于HPV感染的HNSCC患者持續(xù)表達E6、E7腫瘤蛋白，其可作為免疫治療的另一靶點，目前已有相關(guān)研究正在開展[26]，探討蛋白靶點與現(xiàn)有的免疫檢查抑制劑聯(lián)合是否能產(chǎn)生協(xié)同的效果值得探索。細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)在調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)中表達，是調(diào)節(jié)Treg細胞功能及抗腫瘤免疫活性的關(guān)鍵分子。研究顯示，CTLA-4(+)的Treg細胞在頭頸部癌中增多[27-28]，特別是在PD-1(+)及CTLA-4(+)的Treg細胞中。在HNC中，不同免疫微環(huán)境下CTLA-4的具體意義尚存在爭議。在Oncomine數(shù)據(jù)庫中，有一項CTLA-4在HNC中呈現(xiàn)高表達的研究，但因缺乏與其相關(guān)的CD80、CD86、PD-1等分子分型數(shù)據(jù)，未具體分析其表達特點。本文利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)分析時，仍存在一些缺陷，因缺乏如多種實驗方法確定PD-L1表達，關(guān)于PD-1、CTLA4相關(guān)表達數(shù)據(jù)，及臨床數(shù)據(jù)如煙草接觸等重要臨床數(shù)據(jù)，無法對腫瘤相關(guān)基因、腫瘤分子分型及臨床病理特征做進一步深入分析。

共表達分析中顯示與PD-L1共表達的基因包括RAC2、EPHB2、FLNA等，目前尚未有關(guān)于這些基因的內(nèi)在聯(lián)系機制的研究，我們亟待進一步的研究探索。目前Oncomine數(shù)據(jù)庫關(guān)于PD-L1、PD-1、CTLA-4相關(guān)的數(shù)據(jù)仍較為有限，希望隨著免疫治療的普及和推廣，具有更全面和細化的數(shù)據(jù)及分類。

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