吳小延，劉小云，邵瓊， 龍亞康， 王芳， 李月

510060 廣州，中山大學腫瘤防治中心， 華南腫瘤學國家重點實驗室，腫瘤醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新中心

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%。膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma,GBM)可分為原發(fā)性GBM和繼發(fā)性GBM。目前，膠質(zhì)瘤的標準病理學診斷依據(jù)是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)制定的分級系統(tǒng)，即根據(jù)組織學形態(tài)和分子檢測結(jié)果將其分為Ⅰ～Ⅳ級[1]。IDH1基因突變是2008年P(guān)arsons等[2]首次在膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)，并且被各國學者證實為影響膠質(zhì)瘤預后的重要標志[3]。大量臨床膠質(zhì)瘤的病例-對照研究發(fā)現(xiàn)，IDH1基因突變好發(fā)于超過75%的低級別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅱ～Ⅲ級)和90%的繼發(fā)性高級別膠質(zhì)細胞瘤[4]。因此，IDH1基因突變被認為是膠質(zhì)瘤發(fā)生的早期事件，可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生的驅(qū)動因子，對膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響[5]?，F(xiàn)在普遍認為IDH1突變是初級膠質(zhì)瘤和sGBM的確定性分子標志物[6]。超過90%的IDH1突變發(fā)生于4號外顯子上第132位氨基酸堿基序列(CGT突變?yōu)镃AT)，導致其編碼的氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(R132H)。常規(guī)組織病理學在膠質(zhì)瘤的分型方面具有一定的局限性，而近期研究發(fā)現(xiàn)IDH1突變狀態(tài)可輔助病理及臨床醫(yī)師對膠質(zhì)瘤進行更加精準的診斷分型[2]。目前，臨床常用的IDH1突變檢測方法主要為免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)和Sanger測序法，然而對于二者檢測IDH1基因突變一致性的比較分析鮮有報道，方法選擇策略尚待明確。

本研究中，我們回顧性地收集了657份膠質(zhì)瘤患者腫瘤樣本，同時利用Leica全自動免疫組化系統(tǒng)與Sanger測序法檢測IDH1基因突變，評估兩種檢測技術(shù)的檢測效能及一致性，為臨床及病理醫(yī)生在IDH1突變不同檢測方法的選擇上提供指導依據(jù)。

1 材料與方法1.1 標本來源

收集2014年至2019年中山大學腫瘤防治中心手術(shù)切除且經(jīng)病理確診為膠質(zhì)瘤及其它神經(jīng)上皮性腫瘤標本657例，其中男性371例，女性285例，平均年齡(40.5±17.5)歲，范圍(1～81歲)。病理分級依據(jù)2007年版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理分級標準：Ⅰ級54例(毛細胞星形細胞瘤50例、室管膜下瘤2例、胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤1例、室管膜下巨細胞星形細胞瘤1例)，Ⅱ級192例(星形細胞瘤119例、少突膠質(zhì)細胞瘤50例、室管膜瘤8例、少突星形細胞瘤4例、多形性黃色星形細胞瘤4例、節(jié)細胞膠質(zhì)瘤4例、中樞神經(jīng)細胞瘤2例、腦室外神經(jīng)細胞瘤1例)，Ⅲ級118例(間變型星形細胞瘤59例、間變型少突膠質(zhì)細胞瘤33例、間變型室管膜瘤15例、間變型少突星形細胞瘤5例、間變型毛細胞型星形細胞瘤2例、節(jié)細胞膠質(zhì)瘤1例、間變型多形性黃色星形細胞瘤1例、乳頭狀腦膜瘤1例、間變型節(jié)細胞膠質(zhì)瘤1例)，Ⅳ級293例(原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤248例、繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤18例、彌漫中線膠質(zhì)瘤15例、組織類型未明膠質(zhì)瘤6例、膠質(zhì)肉瘤4例、非典型畸胎樣/橫紋肌樣腫瘤1例、髓母細胞瘤1例)。

1.2 IHC

常規(guī)石蠟包埋組織切片，厚3～4 μm，65℃烤片1h。使用IDH1-R132H即用型鼠抗人單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，采用Laica全自動免疫組化儀(Leica Microsystems Nussloch GmbH)進行檢測。陽性判讀標準：≥10%的腫瘤細胞胞漿內(nèi)有棕黃色或棕褐色顆粒。

1.3 Sanger測序法

常規(guī)石蠟包埋組織切片，根據(jù)HE染色結(jié)果，富集腫瘤細胞區(qū)域(大于60%)并按試劑盒說明書進行組織DNA提取(FFPE DNA Kit試劑盒，QIAGENA公司)。IDH1基因4號外顯子擴增引物由上海英濰捷基公司合成，IDH1正向引物F：5’-TGCCACCAACGACCAAGTCA-3’；反向引物R：5’-CCTTGCTTAATGGGTGTA-3’，擴增產(chǎn)物長度為290 bp。配置25 μL PCR反應體系：DNA模板5 μL,IDH1引物上下游使用液各(10 μM)1 μL，2×Premix EX TapTM12.5 μL，去離子水5.5 μL。PCR反應條件為94 ℃ 5 min；94℃ 30s,56℃ 30s，72℃ 30s，共32個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保溫。使用ABI3500XL型測序分析儀進行雙向測序，使用Chromas軟件分析測序結(jié)果，根據(jù)堿基信號峰圖判定是否存在突變。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用R語言軟件進行統(tǒng)計學分析，IHC與Sanger測序法的差異及一致性比較采用配對χ2檢驗及Kappa一致性檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；Kappa≥0.75兩者一致性較好，0.4≤Kappa<0.75兩者一致性中等，Kappa<0.4兩者一致性較差[7]。

2 結(jié) 果

2.1 IHC檢測IDH1基因突變

IDH1R132H陽性主要分布于細胞漿(圖1)。本研究結(jié)果顯示，35.0%(230/657)標本可見IDH1R132H蛋白表達(表1)。另有49例標本檢測結(jié)果為少量陽、弱陽等可疑陽性，經(jīng)Sanger測序進一步驗證，其中23例為陽性，26例為陰性。

圖1 膠質(zhì)細胞瘤形態(tài)學HE染色及相應的IDH1R132H表達(×100)

Figure 1. HE Staining and CorrespondingIDH1R132H Expression of Gliomas (×100)

Panel A and B show morphology ofIDH1wild-type glioma by HE staining and negative results ofIDH1R132H by IHC staining; Panel C and D show morphology ofIDH1-mutant glioma by HE staining and positive results ofIDH1R132H by IHC staining. HE: hematoxylin eosin.

2.2 Sanger測序法檢測IDH1基因突變

在膠質(zhì)瘤中，IDH1基因最常見突變位點為4號外顯子第132位密碼子的錯義突變(CGT>CAT，R132H)。本研究657例樣本中，38.8%(255/657)檢測出IDH1R132基因點突變(表1),其中R132H突變251例(98.4%)，R132G(132位精氨酸突變?yōu)楦拾彼?突變2例(0.8%)，R132C(132位精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?及R132S(132位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸)各1例(0.4%)(圖2、3，表2)。此外，11例樣本經(jīng)Sanger測序檢測失敗進一步行IHC檢測，結(jié)果顯示其中7例陰性，3例為陽性，1例組織掉片無法檢測。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Figure 2. Results of Agarose Gel Electrophoresis Agarose gel electrophoresis shows that PCR amplification products ofIDH1are 290 bp in length. Marker 1-5 are five randomly selected samples ofIDH1mutation. PCR: Polymerase chain reaction.

表1 IHC與Sanger測序法檢測結(jié)果比較

Table 1. Results of IHC and Sanger Sequencing

Pathological typeWHO gradeNIHCSanger sequencingPositive (%)Mutation (%)Pilocytic astrocytomaI501(2)0(0)SubependymomaI20(0)0(0)Embryogenic dysplastic neuroepithelial neoplasmI10(0)0(0)Subependymal giant cell astrocytomaI10(0)0(0)Total (I)I541(1.9)0(0)AstrocytomaII11972(60.5)85(71.4)OligodendrogliomaII5042(84)44(88)EpendymomaII80(0)0(0)OligoastrocytomaII42(50)2(50)Pleomorphic xanthoastrocytomaII40(0)1(25)GangliogliomaII41(25)2(50)Central neurocytomaII20(0)0(0)Extraventricular neurocytomaII10(0)0(0)Total (II)II192117(60.9)134(69.3)Anaplastic oligodendrogliomaIII5933(55.9)36(61.0)Anaplastic ependymomaIII3327(81.8)27(81.8)Anaplastic ependymomaIII150(0)0(0)Anaplastic oligoastrocytomaIII55(100)5(100)Anaplastic pilocytic astrocytomaIII20(0)0(0)GangliogliomaIII10(0)0(0)Anaplastic Pleomorphic xanthoastrocytomaIII10(0)0(0)Papillary meningiomaIII10(0)0(0)Anaplastic gangliogliomaIII11(100)1(100)Total (III)III11866(55.9)69(58.5)Primary GBMIV24834(13.7)38(15.3)Secondary GBMIV1811(61.1)12(66.7)Diffuse midline gliomaIV150(0)0(0)GliosarcomaIV40(0)0(0)Atypical teratoid/rhabdoid tumorIV10(0)0(0)MedulloblastomaIV10(0)0(0)UncertainIV61(16.7)2(33.3)Total (IV)IV29346(15.7)52(17.7)Total (I-IV)657230(35.0)255(38.8)

IHC: Immunohistochemistry; WHO: World Health Organization.

表2 255例腦膠質(zhì)瘤中IDH1突變位點分布

Table 2. Distribution ofIDH1Mutations in 255 Cases of Glioma

Mutation siteAmino acid changeNMutation rate (%)G395AR132H25198.4C394TR132C10.4C394GR132G20.8C394AR132S10.4

圖3IDH1野生型和IDH1突變型的Sanger測序結(jié)果

Figure 3. Sanger Sequencing Results of Wild-Type and MutatedIDH1

2.3 IHC與Sanger測序法檢測結(jié)果比較

本研究共納入657例標本，其中49例IHC結(jié)果可疑、11例Sanger測序失敗，共有597例標本同時完成IHC及Sanger測序檢測。其中，94.5%(564/597)檢測結(jié)果一致，僅有5.5%(33/597)兩種方法檢測結(jié)果存在差異。兩者檢測結(jié)果通過配對χ2檢驗比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.49，表3);通過Kappa一致性檢驗分析，兩種檢測方法的結(jié)果具有較好的一致性(Kappa=0.88)。

表3 IHC和Sanger測序法檢測結(jié)果的配對χ2檢驗分析

Table 3. McNemar-Bowker Test for Results of IHC and Sanger Sequencing

IHCSanger sequencingPositiveNegativeTotalPositive21314227Negative19351370Total232365597

IHC: Immunohistochemistry.

兩種檢測方法不一致的33例標本中，14例IHC檢測為陽性而Sanger測序為陰性，19例IHC檢測為陰性而Sanger測序為陽性。

2.4 高通量測序法驗證IHC和Sanger測序不一致標本

本研究中，共有33例樣本經(jīng)兩種方法檢測后結(jié)果不一致，我們對其中11例進行高通量測序驗證，其余22例因核酸質(zhì)量不足而無法進行進一步驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6例原本是IHC陽性、Sanger測序陰性的標本，高通量測序結(jié)果為5例陽性，1例陰性；5例原本是Sanger測序陽性、IHC陰性的標本，高通量測序結(jié)果全部為陽性(圖4，表4)。

表4 高通量測序法驗證IHC和Sanger測序結(jié)果不一致標本

Table 4. High-Throughput Sequencing Verifying Specimens with Inconsistent Results Detected by IHC and Sanger Sequencing

IDH1NGS+NGS-TotalIHC+Sanger-516IHC-Sanger+505

NGS: Next-generation sequencing; IHC: Immunohistochemistry; Sanger: Sanger sequencing.

圖4IDH1R132H 突變型的高通量測序結(jié)果

Figure 4. Results ofIDH1R132H Mutations Detected by High-Throughput Sequencing

2.5 原發(fā)性與繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤比較

266例IV級膠質(zhì)母細胞瘤中，248例為原發(fā)性，18例為繼發(fā)性。檢測結(jié)果顯示，繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤IDH1基因突變陽性率明顯高于原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤(P=0.025，表5)。繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤中IDH1基因突變陽性率在IHC和Sanger測序中分別為61.1%和66.7%，原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤陽性率分別為13.7%和15.3%。

表5 原發(fā)性GBM和繼發(fā)性GBMIDH1基因突變率結(jié)果的比較

Table 5.IDH1Mutation Rates of Primary and Secondary GBM

Pathological typeNNumber of positive cases (%)IHCSanger sequencingPrimary GBM24834(13.7)38(15.3)Secondary GBM1811(61.1)12(66.7)

GBM: Glioblastoma; IHC: Immunohistochemistry.

3 討 論

位于染色體2q33上的IDH1基因，編碼異檸檬酸脫氫酶，其作用是催化異檸檬酸氧化為草酰琥珀酸，然后轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，導致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的產(chǎn)生。在人類基因組中編碼的5種異檸檬酸脫氫酶蛋白中，至少有3種位于線粒體中，而IDH1位于細胞質(zhì)和過氧化物酶體內(nèi)[8]。IDH1蛋白酶形成一個非對稱性同源二聚體，是細胞三羧酸循環(huán)中重要的限速酶[9],并被認為通過產(chǎn)生NADPH在細胞控制氧化損傷中發(fā)揮重要作用，而IDH2與IDH3主要參與細胞的能量代謝[10]。早期研究發(fā)現(xiàn)IDH1的突變與腦膠質(zhì)瘤密切相關(guān)[2,11]，之后又發(fā)現(xiàn)其與前列腺癌、副神經(jīng)節(jié)瘤、大腸癌、膽管癌、軟骨肉瘤以及急性髓細胞白血病相關(guān)[12]。其致瘤機制為突變的IDH能將α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為2-羥戊二酸，且后者可以抑制前者的靶點，導致這些靶點表達異常而引發(fā)癌癥。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在肝內(nèi)膽管細胞癌中，也有IDH1突變[13]。隨著研究的不斷深入，越來越多的研究證實，IDH1基因突變與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要關(guān)系[14]。

IDH1在膠質(zhì)瘤中突變類型均是堿基錯義突變導致單個氨基酸替換，且突變均發(fā)生于與異檸檬酸鹽結(jié)合部位的進化保守區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的突變類型是R132H，密碼子由CGT突變?yōu)镃AT，與之前文獻報道一致[15]。其它位點可偶見報道，Hartmann等[16]研究表明非R132H突變類型發(fā)生率低于5%。本研究結(jié)果與既往報道結(jié)果相似[17-18]，Sanger測序法僅檢測到4例(1.6%)R132H以外的點突變類型，分別為2例R132G、1例R132C及1例R132S。本研究顯示，這些稀有突變分布在不同的膠質(zhì)瘤亞型中：2例R132G分別發(fā)現(xiàn)于星形細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤；1例R132C發(fā)現(xiàn)于間變型星形細胞瘤；1例R132S發(fā)現(xiàn)于間變型星形細胞瘤，但因例數(shù)過少，無法分析少見IDH1突變類型與組織學分型之間是否存在聯(lián)系,但是有文章發(fā)現(xiàn)這些少見突變類型的發(fā)生可能有譜系偏愛性[19]。關(guān)于這些少見突變是否具有與R132H突變同等重要的鑒別診斷意義及判讀預后價值，尚需更加深入的研究。

我們通過兩種方法進行IDH1突變狀況的分類，結(jié)果顯示，不同組織病理分型中突變陽性率存有一定的差異性，在54例Ⅰ級膠質(zhì)瘤中，僅有1例毛細胞型星形細胞瘤可見IDH1基因突變，其發(fā)生機制可能與其他低級別膠質(zhì)瘤不同[20]。另一方面，也提示我們對于低級別星形細胞瘤，當組織病理學診斷不明確，無法區(qū)分彌漫性星形細胞瘤和毛細胞型星形細胞瘤時，可通過IDH1基因突變檢測加以鑒別，以便給患者帶來最適合的治療方案，取得最好的治療效果[21]。本研究中，兩種檢測方法的結(jié)果顯示，IDH1基因突變陽性率在Ⅱ～Ⅲ級的星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤中及Ⅳ級繼發(fā)性GBM中較高，而在原發(fā)性GBM中IDH1基因突變陽性率較低(約15%)(表1)，原發(fā)性GBM中IDH1基因突變率與國內(nèi)外文獻報道基本一致(11.39%～17.64%)[21-29]。以往的研究表明，繼發(fā)性與原發(fā)性GBM發(fā)病機制有所不同，原發(fā)性GBM病變迅速出現(xiàn)，惡性前體病變的臨床證據(jù)比較少，而繼發(fā)性GBM從低級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展而來[30]。WHO Ⅱ級中少突星形細胞瘤突變率為50%(2/4)、4例多形性黃色星形細胞瘤突變率為25%(1/4)、4例節(jié)細胞膠質(zhì)瘤突變率為50%(2/4)，其他間變型室管膜瘤、間變型毛細胞型星形細胞瘤、間變型多形性黃色星形細胞瘤等其他類型腫瘤中均未發(fā)現(xiàn)IDH1基因突變。WHO Ⅲ級中5例間變型少突星形細胞瘤和1例間變型節(jié)細胞膠質(zhì)瘤均可見突變；以上研究說明IDH1突變頻繁發(fā)生于一些特定類型的膠質(zhì)瘤，特別是星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤中，而在室管膜瘤、髓母細胞瘤等其他膠質(zhì)瘤中罕見發(fā)生[31]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IHC與Sanger測序法檢測IDH1基因突變結(jié)果具有較好的一致性(Kappa=0.88)。Sanger測序法是目前測定IDH1突變的最常用方法，可檢測具體的突變位點，但操作較為繁瑣，對實驗室環(huán)境設備及技術(shù)員操作技能要求高。來源于腫瘤周圍正常腦組織及淋巴細胞的DNA可能將低豐度的突變序列稀釋，導致其低于檢測閾值而呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。另外，Sanger測序法敏感性較低，需要至少20%突變的等位基因才能得出準確的結(jié)果[32]。IHC法操作簡單，絕大多數(shù)病理實驗室均可以開展，無論手工還是自動化儀器均可獲得較為滿意的結(jié)果，但有時免疫組化儀染色可能出現(xiàn)背景偏深或局灶少量染色難以明確判讀，給病理醫(yī)師的診斷分型帶來困難，甚至產(chǎn)生假陽性結(jié)果。本研究中，有49例IHC結(jié)果為弱陽性、少量陽性及不確定等難以明確分類的樣本，經(jīng)Sanger測序均得到了明確的判讀結(jié)果，即23例為突變型，26例為野生型。由此可見，對于IHC結(jié)果可疑或無法判讀的樣本，進一步進行Sanger測序檢測有助于明確結(jié)果，為臨床和病理醫(yī)師提供更多診斷依據(jù)。

本研究中有14例IHC檢測陽性，但Sanger測序檢測為陰性的病例，Sanger測序假陰性的結(jié)果可能與腫瘤細胞含量較低有關(guān)。值得注意的是，4例為R132H以外的少見突變位點陽性的樣本(1例R132C突變、2例R132G突變及1例R132S突變)均為Sanger測序檢測陽性，但IHC為陰性。這是因為IHC所用抗體主要針對R132H位點突變設計，并不適用于其他類型的突變，這會導致少見突變位點漏診的情況發(fā)生。而Sanger測序法則不受此局限，因為它可明確讀出目標區(qū)域的堿基序列，所以無論是已知突變位點還是未知突變位點都可以檢測到。由于常規(guī)組織病理在膠質(zhì)瘤診斷分型方面具有一定的局限性，IDH1-R132基因位點突變檢測的輔助診斷價值日益凸顯。高通量測序法的驗證結(jié)果顯示，分子病理診斷應用于臨床的重要性，而分子標志物對腫瘤分類、預后判斷和進展預測都有重要意義。2016年新版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》認為組織學與分子病理分類結(jié)果存在分歧時首先考慮分子病理診斷，然而組織學分型十分重要，不能單獨依據(jù)分子病理結(jié)果對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類。中樞神經(jīng)系統(tǒng)WHO腫瘤分級依然按照組織學標準進行[33]。所以在臨床實踐中，應根據(jù)實際情況選擇檢測方法，必要時IHC與Sanger測序應互為補充，以獲得更加精準的檢測結(jié)果。

基于IDH1基因突變對膠質(zhì)瘤具有重要的生物學意義和治療價值，目前靶向IDH1基因突變的藥物研發(fā)成為醫(yī)藥界的研究熱點。例如，小分子化合物AGI-5198和AGI-6780、針對包含IDH1R132H氨基酸123～142的多肽疫苗以及能激活CD8+T細胞的IDH1 R132H的多肽疫苗[34-37]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)周細胞也可以作為膠質(zhì)瘤潛在的治療靶點[38]。

綜上所述，IDH1突變主要發(fā)生在WHOⅡ、Ⅲ和Ⅳ級的星形細胞、少突膠質(zhì)細胞以及繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤中。IHC和Sanger測序法檢測IDH1基因突變的結(jié)果具有較高的一致性，兩種平臺方法都比較成熟，基本上能夠滿足臨床檢測需求。目前尚無一種突變檢測方法可以完全避免假陰性或者假陽性而完全準確地檢測出基因變異結(jié)果，各有優(yōu)勢和不足：免疫組化染色簡單、快捷、檢測費用相對較低且結(jié)果穩(wěn)定，但有時全自動免疫組化儀染色結(jié)果背景偏深，易出現(xiàn)判讀困難和假陽性現(xiàn)象；Sanger測序可檢測已知和未知突變位點，有降低假陰性結(jié)果的產(chǎn)生的優(yōu)勢，但Sanger測序耗時長，檢測費用高，對實驗室環(huán)境要求高。在臨床實踐中，如有必要應結(jié)合多種檢測方法以得到準確的結(jié)果，以更快地輔助病理診斷及臨床治療，也為抗膠質(zhì)瘤藥物的研發(fā)提供參考。

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