何學(xué)友，蔡守平，鄭 宏，曾麗瓊，陳文玉，林曦碧，詹祖仁

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院、國家林業(yè)局南方山地用材林培育重點實驗室，福建 福州 350012；2.龍巖市新羅區(qū)森林病蟲害防治檢疫站，福建 龍巖 364000； 3.泉州森林公園管理處，福建 泉州 362000； 4.明溪縣森林病蟲害防治檢疫站，福建 明溪 365200；5.尤溪縣森林病蟲害防治檢疫站，福建 尤溪 365100)

羅漢松(Podocarpusmacrophyllus)和竹柏(Podocarpusnagi)是我國園林綠化、庭園景觀的重要樹種，尤其是羅漢松經(jīng)濟價值大，種植數(shù)量多，我國每年均要從境外大量引種。橙帶藍尺蛾(MilioniabasalisWalker)屬鱗翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)藍尺蛾屬 (MilioniaWalker)，是近年來在我國南方地區(qū)羅漢松和竹柏上發(fā)生的一種重要食葉害蟲[1-2]，發(fā)生嚴(yán)重時，將寄主植物的葉片取食殆盡，只剩光禿的枝干，我國廣西、廣東、海南、臺灣等地區(qū)以及國外的日本有發(fā)生和危害報道[3]。近年來，福建省各地也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該蟲的危害，尤其在漳州、龍巖、泉州、三明、福州等地苗圃的羅漢松、竹柏發(fā)生十分嚴(yán)重，株蟲口密度高達數(shù)百頭，甚至上千頭，造成較大損失。王緝健等[2]首次報道了該蟲在廣西危害竹柏的生物學(xué)特性，林偉等[1]報道了該蟲在廣東的發(fā)生，記述了該蟲的形態(tài)學(xué)并提出防控建議，橙帶藍尺蛾存在明顯的擴散蔓延風(fēng)險。目前，該蟲的防治多以暴發(fā)時噴施化學(xué)農(nóng)藥為主，尚未見其生物防治的報道。因此，探尋該蟲的有效防治方法，尤其是生物防治顯得十分必要。本文在比較不同金龜子綠僵菌菌株的菌落生長速度、產(chǎn)孢量的基礎(chǔ)上，測定其對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力，旨在篩選出優(yōu)良菌株，為橙帶藍尺蛾的防治提供生物防治資源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

致病力測定使用的菌株為金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)(以下簡稱綠僵菌)，菌株具體信息見表1。將各菌株斜面上孢子轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15 d，充分產(chǎn)孢后收集孢子用于接種試驗。

表1 供試金龜子綠僵菌菌株寄主與地理來源

1.2 菌株菌落生長速度及產(chǎn)孢量

菌株菌落生長速度和產(chǎn)孢量測定參考蔡守平[4]方法，每5 d采用十字交叉法測定1次菌落直徑，產(chǎn)孢量測定采用打孔器取菌碟法。每個菌株做3個重復(fù)，每個重復(fù)產(chǎn)孢量測定時均取3個菌碟，計數(shù)方法采用血球計數(shù)板法。

1.3 綠僵菌對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力

1.3.1 試蟲飼養(yǎng) 試蟲為橙帶藍尺蛾幼蟲，2019年5月12日采集于尤溪縣羅漢松苗圃，該苗圃羅漢松被橙帶藍尺蛾嚴(yán)重危害。幼蟲采集后即帶回實驗室，置于養(yǎng)蟲籠中，以新鮮羅漢松葉飼養(yǎng)。1 d后挑選活動正常、3～4齡的幼蟲放置于昆蟲飼養(yǎng)盒中，每飼養(yǎng)盒放置15頭，用于致病力測定。

1.3.2 致病力測定 致病力測定參考何學(xué)友等[5]方法，將各綠僵菌菌株的孢子使用0.03%的吐溫-80溶液配制成孢子懸浮液，含量為107孢子·mL-1，使用噴霧法接種，即將配制好的孢懸液均勻噴在幼蟲體表，對照用無菌水進行噴霧。每個菌株接種15頭幼蟲為1個重復(fù)，設(shè)置4個重復(fù)，即每菌株共接種60頭試蟲。處理完畢待蟲體稍干后，以新鮮羅漢松枝葉進行飼養(yǎng)。接種后每天觀察試蟲的死亡情況，每2 d更換1次飼養(yǎng)枝葉，以輕觸試蟲蟲體無任何反應(yīng)為死亡標(biāo)準(zhǔn)，死亡后的試蟲及時移出養(yǎng)蟲盒，置于滅過菌的培養(yǎng)皿進行保濕培養(yǎng)，觀察蟲體是否有菌絲長出及產(chǎn)孢，確定是否被綠僵菌感染。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件處理，根據(jù)觀察結(jié)果統(tǒng)計接種后15 d的幼蟲死亡率和感染率。采用DPS自帶的死亡率—時間機率值分析模塊計算不同綠僵菌對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力，即以時間(d)的對數(shù)值為x，將死亡率轉(zhuǎn)換為機率值，并以機率值為y，模擬出致病力回歸方程，計算致死中時(LT50)，各菌株之間的LT50差異采用比例測定方法來檢驗[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠僵菌菌株的菌落生長速度及產(chǎn)孢量

不同來源的綠僵菌菌株菌落生長速度和產(chǎn)孢量間存在顯著的差異(表2)。菌落生長速度與產(chǎn)孢量之間并沒有顯著的相關(guān)性，主要是由菌株自身特性決定。如MaFZ-16菌株，雖然菌落生長速度較快，15 d菌落直徑可達5.9 cm，但菌落以菌絲生長為主，產(chǎn)孢量最低，僅0.76×108孢子·cm-2；而MaXJ-04菌株15 d菌落直徑為6.1 cm，但產(chǎn)孢量高達1.17×108孢子·cm-2。菌落生長速度最快的為MaZPTR-01菌株，培養(yǎng)15 d的菌落直徑達6.5 cm；其次為MaFZ-13菌株，為6.2 cm。從產(chǎn)孢量看，最高的是MaFZ-13菌株，MaZPTR-01菌株次之，分別為1.33×108孢子·cm-2、1.28×108孢子·cm-2(兩者差異不顯著)，第三為MaXJ-04菌株。

表2 不同綠僵菌菌株的菌落生長速度及產(chǎn)孢量

*：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列中不同小寫字母為差異顯著(P<0.05)；下同。

2.2 綠僵菌對橙帶藍尺蛾幼蟲的致死情況

幼蟲接種孢子懸浮液后1～2 d，大部分幼蟲未表現(xiàn)出感病癥狀；2～3 d后，部分幼蟲出現(xiàn)不活躍、取食減少的情況，少量幼蟲開始死亡。接種MaFZ-13和MaXJ-04菌株的幼蟲死亡速度較快，3～7 d出現(xiàn)死亡高峰，60%以上的幼蟲在這個時段死亡，5～10 d為死亡高峰。此后也有部分幼蟲逐漸死亡，但死亡速度明顯放緩。部分幼蟲死亡后蟲體逐漸變僵硬，不發(fā)臭，保濕培養(yǎng)1～2 d后有白色菌絲長出體表，逐漸長滿全身，隨后出現(xiàn)墨綠或深綠色孢子，后期整個蟲體均布滿粉末狀的分生孢子，從死亡到完全產(chǎn)孢大約需要7 d(圖1)，但也有部分幼蟲死亡后發(fā)臭腐爛。

圖1 橙帶藍尺蛾幼蟲及其被綠僵菌感染狀

橙帶藍尺蛾幼蟲接種不同綠僵菌菌株后死亡情況見圖2，幼蟲死亡率隨時間的增加而逐漸提高，但不同菌株對幼蟲的致死速度間存在顯著差異。接種MaFZ-13和MaXJ-04菌株幼蟲死亡率較高，這2個菌株接種9 d后，幼蟲死亡率達到或超過80%，而其它菌株則低于70%。接種15 d后，MaFZ-13和MaXJ-04菌株對幼蟲的致死率分別達到96.7%和95.0%，其它菌株均低于90%，最低的是MaQL-02菌株，為71.7%。試驗記錄期為15 d，此階段未死亡的幼蟲，后續(xù)也逐漸死亡，但耗時較長，只有接種MaQL-02和MaFZ-16菌株的出現(xiàn)了少數(shù)化蛹的情況，其他處理組均沒有幼蟲化蛹。對照組幼蟲死亡率為10%，未死亡的幼蟲正?；?。

圖2 橙帶藍尺蛾幼蟲接種不同綠僵菌菌株后的累計死亡率

2.3 不同綠僵菌菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力

不同綠僵菌菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力分析結(jié)果見表3。通過死亡機率值—時間模型進行不同菌株的致病力回歸方程模擬，經(jīng)檢驗，各方程擬合程度均達到顯著水平，表明時間與累計死亡率顯著相關(guān)，但不同菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力存在顯著差異。從校正死亡率和僵蟲率方面來看，接種MaFZ-13和MaXJ-04菌株的較高，15 d幼蟲校正死亡率分別達到96.3%和94.4%，僵蟲率分別為75%和71.7%；而接種其它菌株的校正死亡率低于90%，最低的是MaQL-02菌株，僅為68.5%，僵蟲率僅為41.7%。同時，從不同菌株的致死中時(LT50)來看，MaFZ-13菌株最短，MaXJ-04菌株次之，分別為5.01 d和5.48 d，顯著短于其它菌株。

表3 不同綠僵菌菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力

3 結(jié)論與討論

橙帶藍尺蛾目前多以化學(xué)藥劑進行應(yīng)急防治為主，探尋該蟲的生物防治資源尚未見報道。本研究通過測定比較了5株來源不同的綠僵菌菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力，篩選出對橙帶藍尺蛾幼蟲致死率高、致死速度快和感染率好的MaFZ-13和MaXJ-04菌株，且這2個菌株生長速度快，產(chǎn)孢量高，可作為該蟲優(yōu)良的生物防治資源加以利用，林間相關(guān)應(yīng)用技術(shù)有待進一步深入研究。

綠僵菌、白僵菌等蟲生真菌致病機理一般是通過體表侵入害蟲體內(nèi)，并在害蟲體內(nèi)不斷增殖，通過消耗營養(yǎng)、機械穿透、產(chǎn)生毒素等作用使害蟲致死，通常致死害蟲過程需要3～6 d。本研究中橙帶藍尺蛾幼蟲接種致病力高的綠僵菌菌株后死亡高峰出現(xiàn)在3～7 d，符合綠僵菌的致病過程[7-8]。但在防治實踐中，綠僵菌的防治效果還受到林間環(huán)境、寄主免疫抵御等多種因素影響，導(dǎo)致應(yīng)用時防效往往較慢，甚至需要10 d以上，相對化學(xué)農(nóng)藥來說，較慢的致死效應(yīng)會使綠僵菌在橙帶藍尺蛾這種爆發(fā)性的害蟲防治中受到一定限制。為了解決防治時效慢的問題，很多學(xué)者嘗試將真菌殺蟲劑與低劑量農(nóng)藥復(fù)配，以達到協(xié)同增效的作用[9]，提高防治效果，如低劑量印楝素與殺蝗綠僵菌混用比單獨施用綠僵菌相對亞洲小車蝗的LT50縮短了3.17 d[10]；綠僵菌與亞致死劑量敵殺死混用對馬尾松毛蟲的LT50可提前7 d[11]；綠僵菌與亞致死劑量的殺蟲單混合使用后，對椰心葉甲的致死率顯著提高，LT50縮短了2.1 d[12]。其機理是農(nóng)藥通過作用于昆蟲的外骨骼，使真菌更容易侵入害蟲蟲體，這樣既可以達到快速致死的目的又可以提高真菌的感染率，并可大幅減少農(nóng)藥使用量，減少農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境破壞，對避免害蟲產(chǎn)生抗性方面有積極的作用[13-14]。因此，在應(yīng)用綠僵菌生物防治橙帶藍尺蛾過程中，采用菌藥復(fù)配策略值得今后深入開展研究。