薛建昌，梁冰鋒，吳海峰，鄭 浩，孫志平，任 哲

(1.河北省胸科醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050041；2.河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院 護(hù)理系，河北 石家莊 050091；3.河北省胸科醫(yī)院 超聲室，河北 石家莊 050041)

在世界范圍內(nèi)，結(jié)核病是導(dǎo)致死亡的十大原因之一，且隨著耐藥結(jié)核病的日益增多，我國(guó)乃至全球結(jié)核病的疫情防控工作面臨著巨大的挑戰(zhàn)[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World health organization，WHO)估計(jì)，2017年全球范圍內(nèi)約55.8萬(wàn)結(jié)核病患者發(fā)展為對(duì)利福平有抵抗力，其中約82%為多重耐藥結(jié)核病，而且有三個(gè)國(guó)家?guī)缀跽既蚰投嗨幒屠Ｆ侥退幗Y(jié)核病的一半，分別為：印度(24%)，中國(guó)(13%)和俄羅斯聯(lián)邦(10%)[2]?？菇Y(jié)核藥物的敏感性試驗(yàn)(藥敏試驗(yàn))仍是目前診斷耐藥結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但確診周期較長(zhǎng)，嚴(yán)重阻礙著耐藥結(jié)核病的防控工作。故需要更加準(zhǔn)確、快速對(duì)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥情況進(jìn)行檢測(cè)的方法或技術(shù)的推廣。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)利福平等抗結(jié)核藥物基因突變進(jìn)行快速檢測(cè)逐漸被廣泛接受。熒光定量PCR探針熔解曲線法，因檢測(cè)RR-TB耗時(shí)較短、特異度強(qiáng)、靈敏度高和快速易操作等優(yōu)點(diǎn)，逐漸在臨床檢測(cè)中得以應(yīng)用[3-5]。WHO所推薦的新型的分子檢測(cè)方法——Gene Xpert MTB/RIF技術(shù)采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，提取及擴(kuò)增全程閉管操作，全自動(dòng)運(yùn)行與檢測(cè)，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[6-8]。本文首次對(duì)2種結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)方法診斷肺結(jié)核患者涂陽(yáng)標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)，評(píng)估其診斷耐利福平結(jié)核病的效能，進(jìn)一步研究在耐藥結(jié)核病控制中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 收集2016年2月至2018年6月在河北省胸科醫(yī)院就診肺結(jié)核患者臨床標(biāo)本278例，其中包含痰標(biāo)本138例，支氣管肺泡灌洗液140例，痰涂片鑒定均為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性。樣本來(lái)院患者年齡由12歲至66歲，平均年齡為35.70歲；男性患者178例，女性患者100例。

1.2 試劑和材料 Gene Xpert MTB/RIF檢測(cè)試劑盒(Cepheid產(chǎn)品，美國(guó))，結(jié)核分枝桿菌耐藥突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)購(gòu)自廈門(mén)致善生物科技有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 比例法藥敏試驗(yàn) 將待測(cè)結(jié)核菌制備成1 mg/mL的菌懸液，再稀釋成10-2mg/mL，取一接種環(huán)(即0.01 mL)，用劃線法均勻接種到對(duì)照及含0.2 ug/mL RIF的羅氏培養(yǎng)基表面，置于37℃孵育箱培養(yǎng)4 周后讀菌落數(shù)。與對(duì)照相比，≤1%為敏感，>1%為耐藥。

1.3.2 Gene Xpert MTB/RIF技術(shù) 取1 mL標(biāo)本按照配比與處理液進(jìn)行充分混合，靜置15 min，將混合液加入反應(yīng)盒，最后放入檢測(cè)模塊中。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下可直接觀察測(cè)試結(jié)果。MTB數(shù)量以MTB DNA拷貝分為高、中、低(極低)和未檢出進(jìn)行報(bào)告，利福平檢測(cè)結(jié)果為敏感和耐藥。

1.3.3 熒光定量PCR探針熔解曲線法 取1 mL標(biāo)本離心、富集、洗滌后進(jìn)行核酸提取，采用結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，每個(gè)標(biāo)本有兩個(gè)反應(yīng)管，每種突變檢測(cè)FAM和TET兩個(gè)通道熒光信號(hào)，其中標(biāo)本的熔點(diǎn)與陽(yáng)性對(duì)照(每種突變檢測(cè)均有兩種陽(yáng)性對(duì)照)的熔點(diǎn)均一致(誤差不超過(guò)1℃)時(shí)判定為野生型，4個(gè)通道任一通道中標(biāo)本的熔點(diǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照2℃及以上時(shí)判定為突變型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析處理。以傳統(tǒng)的結(jié)核菌比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其他2種方法的靈敏度、特異性等；Kappa檢驗(yàn)分析檢測(cè)結(jié)果的一致性，Kappa值<0.4時(shí)一致性較差，Kappa值0.4～0.75時(shí)中度一致，Kappa值>0.75時(shí)高度一致。組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)方法對(duì)利福平耐藥檢出結(jié)果 278例肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌涂陽(yáng)標(biāo)本，同時(shí)應(yīng)用傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)、Xpert和Melt PCR進(jìn)行利福平的耐藥檢測(cè)。以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)作為對(duì)照，2種結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)方法與對(duì)利福平的耐藥檢出結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1，表2)。

表1 不同檢測(cè)方法的利福平耐藥檢出結(jié)果

檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)RIF耐藥(例)RIF敏感(例)合計(jì)(例)RIF耐藥48452MeltPCRRIF敏感1225226合計(jì)49229278RIF耐藥47653XpertRIF敏感2223225合計(jì)49229278

表2 利福平耐藥檢出結(jié)果差異性分析

檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果RIF耐藥(例(%))RIF敏感(例(%))χ2P傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)49(17.63)229(82.37)MeltPCR52(18.71)226(81.29)0.2070.902Xpert53(19.06)225(80.94)

2.2 兩種結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)方法檢測(cè)性能分析結(jié)果 與傳統(tǒng)的結(jié)核菌比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，Melt PCR法和Xpert法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)分別為97.96%、98.25%、92.31%、99.56%、98.20%、96.21%和95.92%、97.38%、88.68%、99.11%、97.12%、93.30%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，Melt PCR法和Xpert法檢測(cè)涂陽(yáng)臨床樣本中結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥的Kappa值分別為0.940(P=2.235E-55)和0.904(P=1.891E-51)，均為高度一致。

2.3 不同檢測(cè)方法在不同樣本類(lèi)型中利福平耐藥檢出結(jié)果差異分析 278例肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌涂陽(yáng)標(biāo)本，包含痰液標(biāo)本138例，支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本140例。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)、Melt PCR及Xpert對(duì)痰液中利福平的耐藥檢出結(jié)果分別為32例(23.19%，32/138)、35例(25.36%，35/138)和35例(25.36%，35/138)，對(duì)支氣管肺泡灌洗液中利福平的耐藥檢出結(jié)果分別為17例(12.14%，17/140)、17例(12.14%，17/140)和18例(12.86%，18/140)，見(jiàn)表3。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，3種方法同時(shí)對(duì)痰液、同時(shí)對(duì)支氣管肺泡灌洗液中利福平的耐藥檢出結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.234，P=0.890；χ2=0.044，P=0.978)。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)、Melt PCR及Xpert對(duì)痰液中利福平的耐藥檢出率均高于支氣管肺泡灌洗液，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.840，P=0.016；χ2=7.987，P=0.005；χ2=7.043，P=0.008)。

表3 不同檢測(cè)方法對(duì)痰/支氣管肺泡灌洗液檢出結(jié)果

檢測(cè)方法標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)RIF耐藥(例)RIF敏感(例)合計(jì)(例)RIF耐藥32335痰液RIF敏感0103103MeltPCR合計(jì)32106138RIF耐藥16117支氣管肺泡灌洗液RIF敏感1122123合計(jì)17123140RIF耐藥31435Xpert痰液RIF敏感1102103合計(jì)32106138RIF耐藥16218支氣管肺泡灌洗液RIF敏感1121122合計(jì)17123140

2.4 不同檢測(cè)方法在不同帶菌量樣本中利福平耐藥檢出結(jié)果差異分析 Gene Xpert MTB/RIF技術(shù)可以對(duì)樣本中MTB數(shù)量進(jìn)行分析，以MTB DNA拷貝分為高、中、低(極低)和未檢出進(jìn)行報(bào)告。因此，需要進(jìn)一步分析涂陽(yáng)臨床樣本中不同帶菌量對(duì)利福平耐藥結(jié)果檢出的影響。278例肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌涂陽(yáng)標(biāo)本，其中帶菌量低(極低)樣本占34.53%(96/278)、帶菌量中樣本占49.28%(137/278)、帶菌量高樣本占16.19%(45/278)。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)、Melt PCR及Xpert對(duì)帶菌量低(極低)樣本中利福平的耐藥檢出結(jié)果分別為15例(15.63%，15/96)、16例(16.67%，16/96)和17例(17.71%，17/96)，對(duì)帶菌量中樣本中利福平的耐藥檢出結(jié)果均為25例(18.25%，25/137)，對(duì)帶菌量高樣本中利福平的耐藥檢出結(jié)果分別為9例(20.00%，9/45)、11例(24.44%，11/45)和11例(24.44%，11/45)，見(jiàn)表4。進(jìn)一步分析，3種檢測(cè)方法對(duì)同一種樣本檢測(cè)結(jié)果相差不大，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.150，P=0.928；χ2=0.000，P=1.000；χ2=0.335，P=0.846)。3種檢測(cè)方法分別對(duì)帶菌量低(極低)、帶菌量中及帶菌量高樣本中利福平的耐藥檢出結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.476，P=0.788；χ2=1.256，P=0.534；χ2=1.018，P=0.601)。

表4 不同利福平耐藥檢測(cè)方法對(duì)不同帶菌量臨床樣本檢出結(jié)果

檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)RIF耐藥(例)RIF敏感(例)合計(jì)(例)RIF耐藥15116MeltPCRRIF敏感08080合計(jì)158196RIF耐藥24125MeltPCRRIF敏感1111112合計(jì)25112137RIF耐藥9211MeltPCRRIF敏感03434合計(jì)93645RIF耐藥14317XpertRIF敏感17879合計(jì)158196RIF耐藥24125XpertRIF敏感1111112合計(jì)25112137RIF耐藥9211XpertRIF敏感03434合計(jì)93645

3 討論

自20世紀(jì)90年代以來(lái)，全球結(jié)核病疫情開(kāi)始第3次回升，其中耐藥結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)生與傳播是導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)病率居高不下的重要原因之一，同時(shí)我國(guó)是全球30個(gè)結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[9]。目前常用的結(jié)核分枝桿菌耐藥情況分析的方法[10-12]主要為：傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)，BACTEC MGIT 960藥敏法和噬菌體生物擴(kuò)增法等耐藥表型檢測(cè)方法；熒光定量PCR探針熔解曲線法和Gene Xpert MTB/RIF技術(shù)等基因突變檢測(cè)方法。傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)、噬菌體生物擴(kuò)增法和BACTEC MGIT 960藥敏法等利用結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐受情況進(jìn)行分析，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，不能在短時(shí)間內(nèi)報(bào)告結(jié)核患者感染結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況。目前，采用操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確的分子生物學(xué)方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥情況檢測(cè)逐漸被廣泛接受[13]。

應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法，能快速篩查結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)一線抗結(jié)核藥物的耐藥情況[14]。本研究中采用熒光定量PCR探針熔解曲線法針對(duì)涂陽(yáng)臨床樣本中結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行利福平耐藥基因突變檢測(cè)，與傳統(tǒng)的結(jié)核菌比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，Melt PCR法Kappa值為0.940 (P<0.05)，敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)等效能指標(biāo)均在90%以上，與其他研究所報(bào)道[15]具有較高一致性結(jié)果類(lèi)似。同時(shí)在臨床中最常見(jiàn)的兩種臨床樣本(痰液與支氣管肺泡灌洗液)中，主要以痰液為主，且痰液中利福平耐藥檢出率顯著高于支氣管肺泡灌洗液，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？傊?，熒光定量PCR探針熔解曲線法能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)臨床樣本中結(jié)核分枝桿菌的利福平耐藥基因突變情況能夠進(jìn)行有效檢出，且其他檢測(cè)試劑盒(鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇)能夠?qū)ζ渌菇Y(jié)核藥物的耐藥基因突變情況進(jìn)行快速檢測(cè)。

Gene Xpert MTB/RIF技術(shù)是世界衛(wèi)生組織(WHO)大力推廣的集樣本處理、核酸的提取和擴(kuò)增、結(jié)核分枝桿菌核酸特異性檢測(cè)及利福平耐藥基因rpoB突變檢測(cè)于一體的結(jié)核病和利福平耐藥結(jié)核病快速診斷方法[16]。研究顯示[17]，以傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert法檢測(cè)利福平耐藥的敏感度和特異度均在86%以上，這與本研究結(jié)果一致。與傳統(tǒng)的結(jié)核菌比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，Xpert法檢測(cè)利福平耐藥的Kappa值為0.904(P<0.05)，為高度一致。研究中Xpert法除了對(duì)痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥情況進(jìn)行有效、快速檢出，對(duì)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本也顯示出較好的檢測(cè)效果，與丁月荷[18]等人研究結(jié)果一致。但是，Gene Xpert MTB/RIF技術(shù)需要配合其儀器和配套試劑盒使用且只能檢測(cè)利福平的耐藥情況，限制了在地方性醫(yī)院的推廣。

全世界都存在多重耐藥和廣泛耐藥(MDR / XDR)結(jié)核病，但仍以結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)試或抗菌藥物敏感性測(cè)試為主。對(duì)于分子生物學(xué)方法的應(yīng)用，不容忽視的問(wèn)題為：結(jié)核分枝桿菌帶菌量低(極低)的臨床樣本，因提取的核酸濃度有限導(dǎo)致最終的檢測(cè)結(jié)果易產(chǎn)生“假陰性”；當(dāng)樣本中野生型模板背景較高時(shí)，易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的“假陽(yáng)性”；表型耐藥與基因型突變會(huì)存在一定差異；基于基因突變并不能完全涵蓋所有突變位點(diǎn)的檢測(cè)。因此，可以利用表型和基因型檢測(cè)方法互補(bǔ)，提高靈敏度和特異性，用于檢測(cè)耐藥性和準(zhǔn)確預(yù)測(cè)MDR / XDR-TB治愈的敏感性[19]。而在本研究中，Melt PCR法和Xpert法均亦存在上述問(wèn)題；此外，Melt PCR法需要先進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性且核酸濃度較高時(shí)才可進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，操作較為復(fù)雜，但是可以同時(shí)對(duì)幾種藥物和多個(gè)耐藥基因位點(diǎn)的突變情況進(jìn)行檢測(cè)，而其檢測(cè)效率較高；Xpert法相對(duì)人工操作簡(jiǎn)便，全程閉管檢測(cè)，可以有效降低“氣溶膠”污染和對(duì)醫(yī)務(wù)工作者感染的風(fēng)險(xiǎn)，但是在帶菌量低(極低)時(shí)易報(bào)告為利福平“假耐藥”情況，同時(shí)檢測(cè)成本較高且只能檢測(cè)利福平一種藥物的耐藥情況。

綜上所述，熒光定量PCR探針熔解曲線法和Gene Xpert MTB/RIF技術(shù)用于臨床涂陽(yáng)標(biāo)本中檢測(cè)RR-TB，且具有相似的高靈敏度和特異度等檢測(cè)性能，可結(jié)合實(shí)際需求在耐多藥結(jié)核病防治中推廣和應(yīng)用。