胡姍姍，陶 娜，胡玫瑰，黃小容，錢 英，張 蓓

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 藥物臨床試驗機構，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū) 第二臨床醫(yī)學院，廣東 珠海 519041；4.遵義市第一人民醫(yī)院 口腔科，貴州 遵義 563000)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，65歲以上的人群患病率為1%，85歲以上人群患病率為4%～5%[1]。PD的病理特征主要為進行性的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少以及紋狀體多巴胺能神經(jīng)元軸突減少。目前，針對多巴胺能系統(tǒng)的藥物如左旋多巴等可用來治療PD，但其長期應用效果較差，另外，一些藥物包括多巴胺激動劑及抗膽堿能劑等均有一定局限性[2]。

核受體相關蛋白1(Nuclear receptor related 1 protein,Nurr1)屬于孤兒受體家族的核受體，也是一種轉(zhuǎn)錄因子。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Nurr1主要表達于黑質(zhì)、中腦腹側被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元，此外，在嗅球、海馬、皮質(zhì)及僵核中也有表達[3]。Nurr1在多種疾病的發(fā)展過程中有著重要作用，如PD、阿茲海默癥及精神分裂癥等，Nurr1 在神經(jīng)退行性疾病中與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥及細胞凋亡過程有重要聯(lián)系[4]。星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的Nurr1可與NF-κB結合抑制TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥因子的表達。在PD患者黑質(zhì)區(qū)域，大量的星形膠質(zhì)細胞活化，同時，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元區(qū)域的炎癥也是PD的誘發(fā)因素之一[5]。

淫羊藿苷(Icariin,ICA)是淫羊藿的主要成分之一，已有實驗研究結果顯示其緩解阿茲海默病等神經(jīng)退行性病變的機制主要是通過抑制絲裂原活化蛋白激酶通路緩解神經(jīng)元的興奮性毒性[6]。另外，ICA也可用于改善PD樣病理改變，但ICA是否通過影響Nurr1水平來改善PD樣癥狀仍不清楚。因此，本研究利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)制作PD模型，并給予ICA干預，觀察黑質(zhì)Nurr1水平變化及ICA對PD模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量的影響，探討是否與Nurr1的炎癥抑制作用有關。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠24只，購自陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，許可證號SCXK(渝)2012-0005。自由飲水及食物，12 h光照/黑暗循環(huán)，環(huán)境溫度控制在(22±2)℃。

1.2 試劑及藥品 ICA(純度：98%，貨號：489-32-7，辰光生物公司)；MPTP(純度：99.9%，貨號：102417-86-7，美國Sigma公司)；Nurr1抗體(貨號：ab41917，美國Abcam公司)；TNF-α抗體(貨號：ab1793，美國Abcam公司)；IL-1β抗體(貨號：ab9722，美國Abcam公司)；IL-6抗體 (貨號：ab208113，美國Abcam公司)；GFAP抗體(貨號：3670，美國CST公司)；Iba1抗體(貨號：ab220815，美國Abcam公司)；β-actin (貨號：RM2001)；TH抗體(貨號：AB152，美國默克密里博公司)；Alexa Fluor 488-及568-conjugated熒光二抗 (貨號：A31573，A31571，美國Thermofisher公司)；DAB顯色試劑盒 (貨號：CW2069，康為世紀公司)；

1.3 儀器 奧林巴斯CX22顯微鏡；蔡司LSM880共聚焦顯微鏡；冰凍切片機(美國賽默飛公司)；電泳儀(北京六一公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 24只雄性小鼠隨機分成4個組(n=6)，即正常對照組(Con)；PD模型組(MPTP)給予30 mg/kg MPTP(腹腔注射，每天1次，連續(xù)1周)；單純淫羊藿苷組(ICA)給予淫羊藿苷60 mg/kg(灌胃，每天1次，持續(xù)3周)；淫羊藿苷治療組(ICA+MPTP組)給予淫羊藿苷60 mg/kg(灌胃，每天1次，持續(xù)3周)，同時，在第3周給予30 mg/kg MPTP(腹腔注射，每天1次，連續(xù)1周)。

1.4.2 免疫組化檢測 第3周給藥完畢后次日，苯巴比妥麻醉下開胸，剪開右心耳，左心室灌注生理鹽水5 min后將腦完整取出，放入多聚甲醛內(nèi)固定2 d，經(jīng)脫水后石蠟包埋切片(3 μm)，載于載玻片上，經(jīng)復水、抗原修復后滴加Nurr1一抗(1∶200稀釋比例)4℃過夜，次日用DAB顯色試劑盒顯色，鏡下控制顯色程度，蘇木素復染后脫水封片。

1.4.3 免疫熒光檢測 腦組織獲取及固定方法同前，用OCT包埋后-20℃冰凍切片機切片(30 μm)，TH、GFAP及Iba1抗體(1∶500稀釋比例)4℃孵育過夜，次日加入Alexa Fluor 488及568-conjugated熒光二抗(1∶500稀釋比例)室溫孵育1 h后DAPI復染，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.4.4 Western blot檢測 腦組織獲取方法同前，將腦黑質(zhì)分離后提取總蛋白，PAGE膠電泳分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜封閉后，分別與Nurr1抗體、TNF-α抗體、IL-1β抗體及β-actin 抗體(1∶1 500稀釋比例)孵育過夜，二抗孵育1 h，滴加發(fā)光液后顯影拍照，灰度值分析依據(jù)β-actin值進行較正。

2 結果

2.1 ICA對PD小鼠黑質(zhì)Nurr1表達的影響 免疫組織化學染色結果顯示，MPTP組Nurr1陽性細胞數(shù)明顯低于Con組，而ICA+MPTP組Nurr1陽性細胞數(shù)較MPTP組增多(見圖1A)。同時，Western blot結果顯示，MPTP組黑質(zhì)區(qū)域Nurr1表達量較Con組明顯減少(P<0.01)，ICA+MPTP組Nurr1表達量明顯高于MPTP組(P<0.05，見圖1B)。

A：Nurr1免疫組化染色；B：Western blot檢測Nurr1表達量；*：P<0.05；**：P<0.01。圖1 ICA對PD小鼠黑質(zhì)Nurr1表達的影響

2.2 ICA對PD小鼠黑質(zhì)膠質(zhì)細胞數(shù)量的影響 免疫熒光染色結果顯示，在黑質(zhì)網(wǎng)狀部(Substantial nigra reticula,SNr)及黑質(zhì)致密部(Substantial nigra compacta,SNc)，MPTP組星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP及小膠質(zhì)細胞標志物Iba1陽性細胞數(shù)明顯高于Con組(P<0.01)，而ICA+MPTP組GFAP及Iba1陽性細胞數(shù)較MPTP組明顯減少(P<0.05，見圖2A、B)。

A：黑質(zhì)致密部及網(wǎng)狀部GFAP及Iba1免疫熒光染色，藍色：細胞核，紅色：GFAP，綠色：Iba1；B：GFAP及Iba1陽性細胞數(shù)統(tǒng)計分析； *：P<0.05；**：P<0.01。圖2 ICA對PD小鼠黑質(zhì)膠質(zhì)細胞數(shù)量的影響

2.3 ICA對PD小鼠黑質(zhì)炎癥因子表達的影響 Western blot結果顯示，MPTP組黑質(zhì)TNF-α、IL-1β及IL-6炎癥因子表達量較Con組明顯增多(P<0.01)，ICA+MPTP組TNF-α、IL-1β及IL-6炎癥因子表達量明顯低于MPTP組(P<0.05，見圖3)。

A：Western blot檢測TNF-α、IL-1β及IL-6結果；B：TNF-α相對表達量統(tǒng)計分析；C：IL-1β相對表達量統(tǒng)計分析；D：IL-6相對表達量統(tǒng)計分析；*： P<0.05；** ：P<0.01。圖3 ICA對PD小鼠黑質(zhì)炎癥因子表達的影響

2.4 ICA對PD小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的影響 免疫熒光染色結果顯示，MPTP組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元(TH陽性細胞)較Con組明顯減少(P<0.001)，而ICA+MPTP組TH陽性細胞數(shù)較MPTP組明顯增多(P<0.01，見圖4A、B)。

A：小鼠黑質(zhì)TH免疫熒光染色，藍色：細胞核，綠色：TH；B：TH陽性細胞數(shù)統(tǒng)計分析；**：P<0.01；***：P<0.001。圖4 ICA對PD小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的影響

3 討論

本研究利用MPTP制作小鼠PD模型，并參照Li等[7]研究，將ICA劑量設置為60 mg/kg，發(fā)現(xiàn)Nurr1在PD模型小鼠黑質(zhì)表達量明顯減少，而給予ICA干預后，可逆轉(zhuǎn)這種減少。Nurr1是一種孤兒受體中的核受體家族，同時也是一種轉(zhuǎn)錄因子，其主要表達于星形膠質(zhì)細胞。體外研究表明，給予星形膠質(zhì)細胞MPP+后，可導致細胞內(nèi)Nurr1表達水平降低[8]。且有研究表明，PD患者腦組織內(nèi)黑質(zhì)及海馬區(qū)域Nurr1表達量也有降低的趨勢，與本研究結果一致[9]。

膠質(zhì)細胞包括星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞，而星形膠質(zhì)細胞與小膠質(zhì)細胞為腦內(nèi)的主要炎癥細胞，其功能的失調(diào)與數(shù)目的異?？蓪ο嚓P腦區(qū)可產(chǎn)生不同的影響[10]。既往有研究表明，星形膠質(zhì)細胞與小膠質(zhì)細胞的活化參與了PD的進程，而特異性的抑制星形膠質(zhì)細胞或小膠質(zhì)細胞的激活可逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性病變的發(fā)展進程[11]。星形膠質(zhì)細胞可特異性的修剪突觸，對突觸可塑性起到調(diào)節(jié)作用，而過度活化的星形膠質(zhì)細胞可對神經(jīng)元突觸產(chǎn)生異常吞噬，從而損失神經(jīng)元功能。本研究中，給予小鼠MPTP后，黑質(zhì)區(qū)域星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增多，與既往研究一致。而給予ICA后，星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞的數(shù)量較PD模型組減少，提示ICA可抑制星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞增生及活化作用。

星形膠質(zhì)細胞可釋放炎癥因子，包括TNF-α、IL-1β及IL-6等，這3種炎癥因子可對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用[12]。Zhou等[13]研究結果提示，ICA可緩解由脂多糖引起的神經(jīng)炎癥，其主要機制是抑制了TLR4-MYD88-NF-κB通路。我們的實驗結果顯示，PD模型組TNF-α、IL-1及IL-6三種炎癥因子水平較空白對照Con組明顯升高，而給予ICA后，可逆轉(zhuǎn)由MPTP誘導的炎癥因子的上調(diào)，表明ICA可明顯抑制星形膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子。TNF-α、IL-1β及IL-6的產(chǎn)生主要受NF-κB的正性調(diào)控作用，Nurr1可特異性的結合NF-κB，從而抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的產(chǎn)生[14]。在PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)域，Nurr1表達水平明顯降低，且伴有黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少[15]。此外，Saijo等利用慢病毒特異性抑制黑質(zhì)區(qū)域Nurr1后，發(fā)現(xiàn)抑制Nurr1后黑質(zhì)核團TNF-α、IL-1β及IL-6表達水平明顯升高，從而損傷多巴胺能神經(jīng)元[16]。推測可能是由于在PD模型中，Nurr1表達降低，而ICA可通過上調(diào)星形膠質(zhì)細胞的Nurr1水平，從而抑制NF-κB依賴性的炎癥因子的轉(zhuǎn)錄與釋放，從而緩解炎癥。

多巴胺能神經(jīng)元主要存在于中腦腹側被蓋區(qū)與黑質(zhì)致密部，酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)為多巴胺合成的限速酶，PD患者主要由黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的減少導致[17]。本研究中，利用TH染色評估黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量，經(jīng)MPTP腹腔注射1周后，黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元較空白對照Con組明顯減少，而給予ICA后，可逆轉(zhuǎn)這種減少。推測ICA保護多巴胺能神經(jīng)元減少的機制可能是由于ICA通過上調(diào)Nurr1，抑制NF-κB依賴性的炎癥因子的表達，減輕黑質(zhì)區(qū)域炎癥，因此神經(jīng)元免受炎癥因子的刺激得以存活。

綜上所述，ICA具有較強的抗膠質(zhì)細胞激活及數(shù)量增加的作用，且可通過Nurr1抑制膠質(zhì)細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表達，從而使神經(jīng)元周圍環(huán)境保持穩(wěn)態(tài)，緩解PD樣病理改變。