王亞敏 廖衛(wèi)波 陳樂 黃斌 胡燕珍

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

烏蕨[Stenoloma chusanum(L.)Ching]來源于陵齒蕨科烏蕨屬植物全草[1]，在民間素有“萬能解毒藥”之美稱[2]。民間驗方顯示，烏蕨具有消炎止痛、治療腎盂腎炎的功效[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)烏蕨具有抗炎作用，烏蕨提取物能有效降低二甲苯致小鼠耳腫脹，明顯降低小鼠腹腔毛細血管通透性，明顯降低炎癥因子（COX-2、PGE2、TNF-α、NO）的濃度[4]。烏蕨總黃酮及水煎液具有一定的抗炎活性，均能抑制二甲苯致小鼠耳腫脹[5]。烏蕨乙酸乙酯萃取物及水提取剩余物對大鼠急性咽喉炎有改善作用[6]。目前，烏蕨的抗炎活性研究僅限于水和醇提取物體內(nèi)動物實驗研究，并未見不同濃度乙醇洗脫部位體外抗炎效果比較的研究報道。本研究比較不同濃度乙醇洗脫物對RAW264.7 細胞活力及對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎癥模型的影響，以期詮釋烏蕨抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)，篩選抗炎有效部位，為開發(fā)抗炎活性單體化合物奠定基礎(chǔ)，為烏蕨的資源開發(fā)利用、質(zhì)量標準的建立提供參考?，F(xiàn)報道如下：

1 儀器、材料、試劑與方法

1.1 儀器 RE52-98 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），MS105Du 電子分析天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司），DHG-9101-2SA 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），HBS-1096A 酶標分析儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 材料及試劑 DMEM 培養(yǎng)基（GibcoBRL 公司），脂多糖（Sigma Chemical 公司），胰蛋白酶（GibcoBRL 公司），胎牛血清（GibcoBRL 公司），小鼠單核巨噬細胞RAW264.7（上海遠慕生物科技有限公司），青霉素鏈霉素雙抗液（上海遠慕生物科技有限公司），乙醇（廣東光華科技股份有限公司），烏蕨（我院中藥資源普查隊員采集鑒定）。

1.3 實驗方法

1.3.1 烏蕨不同濃度乙醇洗脫部位的制備 烏蕨5 kg 粉碎，在常溫下，先后用95%乙醇、75%乙醇各浸提3 次，減壓濃縮，合并浸膏，再經(jīng)MCI 柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮得到不同濃度乙醇洗脫部位（分別標記為A1、A2、A3、A4、A5）。

1.3.2 烏蕨乙醇洗脫部位對RAW264.7 細胞活力的影響 將貼壁對數(shù)生長期RAW264.7 細胞，以7×104個/孔接種于96 孔板中，依次加入不同濃度（150、300、600 μg/ml）的烏蕨洗脫物100 μl；同時設(shè)置對照組，每組設(shè)5 個平行孔，于5%CO2培養(yǎng)箱中培育24 h 后，每孔加現(xiàn)配的MTT 溶液（5 mg/ml）10 μl，繼續(xù)培育4 h，棄上清液，每孔加入100 μl 的DMSO 溶液，振搖20 min，用酶標儀于570 nm 波長處測定吸光度，計算細胞生長存活率。細胞存活率＝（A 藥物組－A 溶劑劑）/（A 對照組－A 溶劑劑）×100%。

1.3.3 烏蕨乙醇洗脫物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥的影響 將貼壁對數(shù)生長期RAW264.7細胞，以7×104個/孔接種于96 孔板中，依次加入不同濃度（150、300、600 μg/ml）的烏蕨醇洗物（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）各100 μl，培育4 h 后，加入終濃度為1 μg/ml 的LPS 溶液。同時設(shè)置空白對照組、LPS 組、LPS+烏蕨醇洗脫物（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）組，每個濃度組設(shè)3 個平行實驗，培育20 h，每孔加現(xiàn)配的MTT 溶液（5 mg/ml）10 μl，繼續(xù)培育4 h，棄上清液，每孔加入100 μl 的DMSO 溶液，振搖20 min，用酶標儀于570 nm 波長處測定吸光度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。

2 結(jié)果

2.1 烏蕨醇洗脫物對RAW264.7 細胞活力的影響利用MTT 法評價烏蕨各醇洗脫物對小鼠RAW264.7巨噬細胞活力的影響。與對照組相比，烏蕨各洗脫物（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）在（150～600 μg/ml）濃度范圍內(nèi)，細胞存活率均在90%以上；烏蕨洗脫物（水、30%乙醇、95%乙醇）在（150～600 μg/ml）濃度范圍內(nèi)，細胞存活率在95%以上；烏蕨50%乙醇洗脫物、烏蕨70%乙醇洗脫物在濃度為600 μg/ml 時細胞存活率略低。見圖1。本研究選取細胞存活率在95%以上的洗脫物濃度用于后續(xù)實驗。

圖1 烏蕨醇洗脫物對RAW264.7 細胞活力的影響

2.2 烏蕨醇洗脫物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞炎癥的影響 與LPS 組相比，烏蕨各醇洗脫物均能改善LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，且有一定的濃度依賴性；烏蕨洗脫物（50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）能明顯改善LPS 誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；烏蕨洗脫物（水、30%乙醇）在濃度150 μg/ml時對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細胞的炎癥反應(yīng)較弱，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇）烏蕨洗脫物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞的炎癥反應(yīng)明顯優(yōu)于（水、30%乙醇）烏蕨洗脫物，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 烏蕨醇洗脫物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞炎癥的影響

3 討論

本研究采用MTT 法評價細胞存活率，采用LPS 誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7 建立的炎癥模型，評價烏蕨各醇洗脫物的抗炎活性，結(jié)果顯示烏蕨（50%、70%、95%）醇洗脫物具有顯著的降低LPS 誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7 炎癥反應(yīng)的作用；前期實驗顯示烏蕨水、30%乙醇洗脫物量最少，而烏蕨50%、70%乙醇洗脫物量最多，（水、30%乙醇）烏蕨洗脫物與（50%、70%乙醇）烏蕨洗脫物在抗炎活性方面有顯著性差異，因此推測50%、70%乙醇洗脫物為烏蕨最有效抗炎活性部位。本研究中烏蕨50%、70%醇洗脫物在濃度600 μg/ml 時細胞存活率低于95%，所以未對這個濃度進行后續(xù)實驗。

綜上所述，本研究對烏蕨抗炎有效部位進行了系統(tǒng)性研究，可為后期抗炎有效單體成分的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為烏蕨臨床應(yīng)用及質(zhì)量標準的建立提供依據(jù)。