成 鋼，朱慶輝,王嘉琪，徐偉鋼，胡冰潔，崔京珍,趙 銘

(1.湖南文理學(xué)院動物學(xué)湖南省高校重點實驗室/環(huán)洞庭湖生物資源保育與利用研究中心/湖南文理學(xué)院動物健康養(yǎng)殖研究所，湖南 常德 415000；2.湖南省常德市安鄉(xiāng)縣雄韜牧業(yè)有限公司，湖南 常德 415000)

【研究意義】為了充分利用蚓糞特質(zhì)及蚓糞中天然微生物群落減輕養(yǎng)殖廢棄物對環(huán)境的污染，實現(xiàn)肉羊糞尿高效腐熟與發(fā)酵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蚯蚓糞是蚯蚓消化分解有機(jī)廢棄物產(chǎn)生的具有較高孔隙度富含大量微生物菌群的顆粒狀物質(zhì),為了拓寬畜禽糞便無害化和資源化利用的渠道，國內(nèi)外學(xué)者從蚓糞理化性質(zhì)、添加蚓糞到畜禽糞便中進(jìn)行好氧堆肥發(fā)酵及效果測定等方面進(jìn)行過相關(guān)研究[1-4]。雖然從不同類型蚓糞中篩選到一些有益微生物，但在微生物的數(shù)量、類型和特異性方面還存在較多問題[5-6]?！颈狙芯壳腥朦c】試驗以研發(fā)羊糞專用促腐與除臭微生物為切入點，從羊糞養(yǎng)殖蚯蚓后產(chǎn)生的蚓糞中分離和篩選高效促腐與除臭微生物。【擬解決的關(guān)鍵問題】擬解決當(dāng)前羊糞發(fā)酵腐熟影響因素較多，堆肥腐熟時間長、有害氣體釋放多、二次污染嚴(yán)重效率低下，以及堆肥腐熟發(fā)酵缺乏專用高效發(fā)酵與除臭復(fù)合菌劑的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用白菜種子、羊糞、新鮮蚯蚓糞由湖南省常德市雄韜牧業(yè)有限公司提供。葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、乙酸鋅、乙酸鈉等藥品、pH計等由湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院動物科學(xué)專業(yè)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 耐氨、耐硫微生物的培養(yǎng)與富集 以常規(guī)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬丁氏液體培養(yǎng)基為對照，在上述3種培養(yǎng)基中，分別加入10、15、20 μl，25 %氨水和0.5 mol/L濃度的 Na2S溶液，將羊糞養(yǎng)殖蚯蚓后產(chǎn)生的新鮮蚓糞用無菌水稀釋成濃度為10-2～10-5的水溶液，取每個滴度稀釋液100 μl分別加入上述含有氨水和Na2S溶液的3種液體培養(yǎng)基中，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于37 ℃，高氏一號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基于28℃條件下?lián)u菌12～48 h，富集耐氨、耐硫微生物，用于進(jìn)一步高效促腐與除臭微生物的分離和篩選。

1.2.2 高效促腐微生物的初篩與復(fù)篩 分別制備牛肉膏蛋白胨、高氏一號、馬丁氏固體平板培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基表面分別涂布100 μl 濃度為15 %氨水溶液和0.5 mol/L濃度的 Na2S溶液，取上述富集保種微生物，搖菌過夜復(fù)蘇稀釋后，采用平板涂布法按1.2.1中培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌，定期觀察記錄培養(yǎng)皿中菌落生長情況，根據(jù)培養(yǎng)皿中菌落的形態(tài)和數(shù)量，挑選菌落單一、數(shù)量較多、特征明顯的微生物進(jìn)行分類、純化、編號和保種。運(yùn)用瓶裝腐熟發(fā)酵法，挑選20種初篩后微生物制備菌液與新鮮羊糞混合，攪拌混勻后分裝于550 mL 礦泉水瓶中，裝量600 g/瓶，每種微生物設(shè)置在羊糞中的濃度為1×106、2×106和3×106個/g，以新鮮羊糞為空白對照，每種濃度重復(fù)3瓶，在(32±3)℃條件下腐熟發(fā)酵42 d，定期觀測腐熟溫度、pH值、色澤、疏松度、種子發(fā)芽指數(shù)(GI)等指標(biāo)，感官評級法對瓶內(nèi)臭味進(jìn)行評定，并對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[7]。

1.2.3 綜合促腐效果驗證 采用瓶裝腐熟發(fā)酵法在上述初篩、復(fù)篩的基礎(chǔ)上，挑選在溫度、GI值等腐熟指標(biāo)較為突出的5～6 種促腐微生物，分別制備菌液，以3×106個/g濃度添加到新鮮羊糞中，以新鮮羊糞為空白對照，以添加相同濃度大腸桿菌的新鮮羊糞為陰性對照，每個處理重復(fù)3瓶，在在(32±3)℃條件下腐熟發(fā)酵42 d，定期觀測和比較單一菌液和混合菌液瓶內(nèi)的腐熟溫度、pH值、色澤、疏松度、氣味、GI值等指標(biāo)，并對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。羊糞腐熟判定：瓶內(nèi)羊糞溫度趨于環(huán)境溫度，色澤變?yōu)楹谏瑹o刺激性氣味，糞粒疏松柔軟，pH呈弱堿性，含水率≤20 %，GI值≥80 %[8]。

1.2.4 高效除NH3和H2S氣體微生物的初篩 挑選20株耐氨耐硫微生物分別接種于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后得到高濃度菌液。分別將100 μl濃度為1×108個/mL的菌液滴加到直徑2 cm濾紙片上，放入預(yù)先注入30 μl濃度為25 %氨水的瓶中進(jìn)行氨氣的吸收試驗，以添加不含微生物的培養(yǎng)基為空白對照，以相同濃度的葡萄球菌液為陰性對照，在放置24 h后抽取50 mL瓶內(nèi)氣體于硫酸吸收液中充分吸收，利用納氏分光光度法分別測定各瓶中NH3氣體含量，根據(jù)各微生物對瓶內(nèi)NH3氣吸收值，初步篩選對NH3有利于消除能力的微生物。分別取10 mL濃度為1×108個/mL的菌液與100 g羊糞混合，以新鮮羊糞為空白對照，以添加相同濃度的葡萄球菌液為陰性對照，分別在放置24、48和72 h后抽取50 mL瓶內(nèi)氣體于20 mL乙酸鋅乙酸鈉吸收液中進(jìn)行充分吸收，利用碘量法測定各瓶中H2S氣體含量，根據(jù)對瓶內(nèi)H2S氣吸收值初步篩選對H2S具有吸收能力的微生物。

1.2.5 綜合除NH3和H2S氣體效果驗證 挑選初篩對NH3和H2S氣體吸收能力較強(qiáng)的7～9 種微生物單獨制備菌液，以1×108個/mL的濃度分別在200 g/瓶新鮮羊糞中添加5、10、15 mL混合均勻后進(jìn)行綜合除臭效果驗證，運(yùn)用瓶裝腐熟發(fā)酵法，以新鮮羊糞為空白對照，每個處理重復(fù)3瓶，在室溫下放置3 d，每日取各瓶中50 mL氣體分別于硫酸吸收液和乙酸鈉吸收液中各25 mL，令其充分吸收，用納氏試劑風(fēng)光光度法測定NH3含量，用碘量法測定H2S的含量， NH3或H2S氣體每日去除率=(空白組濃度-處理組濃度)/空白組濃度×100 %， NH3或H2S氣體平均去除率為3 d 內(nèi)每日NH3或H2S氣體去除率均值，記錄結(jié)果并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.6 高效促腐除臭微生物的初步鑒定 對1.2.5中進(jìn)一步驗證有除臭功能的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)固體培養(yǎng)基中菌落、菌絲形態(tài)、生長特征及染色鏡檢結(jié)果進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用 Microsoft Excel 2010軟件對促腐溫度與GI值數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗中組間無重復(fù)雙因素方差分析；對除臭數(shù)據(jù)進(jìn)行組間單因素方差分析，用Duncan法對各組間平均值進(jìn)行多重比較，試驗結(jié)果采用字母標(biāo)記法；以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐氨、耐硫微生物富集結(jié)果

羊糞為基料養(yǎng)殖蚯蚓后蚓糞中分離細(xì)菌、放線菌和真菌的最適稀釋梯度均分別為10-4、10-4和10-3。從表1可知，蚓糞中細(xì)菌、放線菌和真菌種類和數(shù)量隨著培養(yǎng)基中氨水添加濃度的增加而降低，試驗以添加0.5 mol/L濃度Na2S處理和添加25 μl氨水處理培養(yǎng)的細(xì)菌、放線菌和真菌作為耐氨、耐硫微生物，用于后續(xù)高效促腐與除臭微生物分離與篩選。

2.2 促腐微生物的初篩與復(fù)篩結(jié)果

以腐熟溫度、pH值及GI值為主要觀測指標(biāo)，從新鮮蚓糞中共分離、篩選獲得4、7、8、11和12號共5株對羊糞具有顯著促腐效果的微生物，且隨著微生物菌劑濃度的升高各處理瓶中的白色菌絲逐漸增多，添加以上5株微生物的處理瓶內(nèi)無刺激性氣味，羊糞顏色變?yōu)楹诤稚|(zhì)地疏松柔軟(表2和圖1)。

表1 不同處理對蚓糞中微生物種類和數(shù)量影響結(jié)果

注：“-”表示未培養(yǎng)出放線菌。

Note: ‘-’ means that no actinomycetes have been cultured.

表2 5種微生物對羊糞腐熟發(fā)酵效果

注：表中“-”代表未發(fā)現(xiàn)菌絲；“+”代表羊糞粒具有一定的疏松度，發(fā)酵腐熟效果一般；“++”代表羊糞粒較松散，發(fā)酵腐熟較好；“+++”代表羊糞粒開裂程度較大松軟，發(fā)酵腐熟效果好。

Note: The ‘-’ in the table indicates that no mycelium is found; ‘+’ indicates that the goat manure has a certain degree of looseness, and the effect of fermentation is poor; ‘+ +’ indicates that the goat manure is relatively loose, and the fermentation is better; ‘+ + +’ indicates that the cracking degree of the goat manure is relatively soft, and the effect of fermentation is good.

圖1 不同微生物與羊糞混合發(fā)酵第10天各瓶中的菌絲生長情況Fig.1 Growth of hyphae in different bottles on the 10th day of mixed fermentation of different microorganisms and goat manure

2.3 綜合促腐效果驗證結(jié)果

2.3.1 5種微生物對羊糞腐熟發(fā)酵溫度的影響 溫度是影響羊糞腐熟發(fā)酵的重要因素，從圖2～3可知，添加微生物菌液各瓶中羊糞經(jīng)歷了3次溫度較大的變化：各處理瓶內(nèi)溫度均在第6～8天內(nèi)快速上升至35 ℃左右，與環(huán)境溫度相差(3±2)℃；腐熟發(fā)酵第18～24天，各實驗瓶內(nèi)溫度均在此期間達(dá)到40 ℃以上，較空白對照高2～5 ℃，與環(huán)境溫差5～7 ℃，腐熟發(fā)酵第34～36天，各處理瓶內(nèi)溫度均高于空白對照1.5～6 ℃，加入混合菌液腐熟發(fā)酵第36天瓶內(nèi)溫度較空白對照組高6 ℃；腐熟發(fā)酵35 d后，各處理堆肥溫度迅速下降，并趨于環(huán)境溫度。取各組處于高溫腐熟發(fā)酵階段時期溫度均值進(jìn)行無重復(fù)雙因素方差分析，結(jié)果處理組與空白組差異顯著(P<0.05)，處理為有效處理，即在羊糞中添加篩選出的微生物對羊糞腐熟發(fā)酵的溫度有影響。

圖2 5種微生物發(fā)酵42 d間溫度觀測結(jié)果Fig.2 Temperature observation results of 5 kinds of microorganisms during 42 days fermentation

圖3 5種微生物不同發(fā)酵腐熟階段溫度觀測比較Fig.3 Temperature observation and comparison of five microorganisms in different fermentation and maturity stages

2.3.2 不同微生物對羊糞腐熟發(fā)酵pH值的影響 試驗每隔2 d對各處理瓶內(nèi)羊糞進(jìn)行pH值運(yùn)用pH計進(jìn)行測定，各瓶pH值變化曲線與各瓶溫度變化水平相一致。發(fā)酵初期，各瓶內(nèi)pH值均上升，可能與此期羊糞中可利用氮較多，微生物生長繁殖較快，生成較多氨類復(fù)合物所致；隨著微生物活動，有機(jī)酸含量增加，發(fā)酵至14 d左右，各處理瓶內(nèi)pH值下降至8.5左右；腐熟發(fā)酵至21 d，隨著瓶內(nèi)微生物分解，以及含氮有機(jī)物所產(chǎn)生氨的堆積，致使瓶內(nèi)pH值又開始上升；發(fā)酵腐熟結(jié)束時，各處理pH值在7.91～8.33，均符合羊糞腐熟的pH值標(biāo)準(zhǔn)。取各組pH值均值進(jìn)行無重復(fù)雙因素方差分析，結(jié)果各處理組與空白組差異顯著(P<0.05)，處理為有效處理，即在羊糞中添加篩選出的微生物對羊糞腐熟發(fā)酵時期的pH值有影響(圖4～5)。

圖5 5種微生物不同發(fā)酵腐熟階段pH值Fig.5 pH value of five microorganisms in different fermentation and maturity stages

圖6 5種微生物單一與混合菌液與羊糞發(fā)酵GI值 Fig.6 GI value of single and mixed bacterial liquid and goat manure fermentation of five microorganisms

2.3.3 不同微生物對羊糞腐熟發(fā)酵GI值的影響GI值是評價發(fā)酵堆料毒性最直觀、有效的參數(shù)指標(biāo)之一。各處理腐熟的GI值在發(fā)酵30 d后均呈上升趨勢，發(fā)酵腐熟30 d時，各處理瓶的GI值均大于80 %，說明各處理瓶內(nèi)的羊糞均趨于腐熟，其中各試驗組GI值在發(fā)酵第30和40天期間，GI值均大于空白對照組；腐熟40 d，添加混合菌液的GI值為123.33 %，分別較空白處理瓶和對照處理瓶高16.66 %和12.33 %，腐熟效果最好(圖6)。

圖7 篩選獲得的微生物對NH3或H2S氣體平均去除率Fig.7 Average removal rate of NH3 or H2S gas by microorganism selected

2.4 除臭微生物分離篩選結(jié)果

從20株耐氨耐硫微生物中初篩獲得10種對NH3或H2S氣體有一定吸除能力的微生物，運(yùn)用瓶裝腐熟發(fā)酵法，綜合除NH3和H2S氣體效果驗證，獲得7株對NH3具有顯著吸除作用的微生物，其中細(xì)菌4株、真菌3株，與空白對照相比，在3 d內(nèi)對NH3的平均去除率分別為77 %、86 %、90 %、89 %、85 %、83 %和79 %；獲得5株對H2S具有顯著吸除作用的微生物，其中細(xì)菌3株、真菌2株，對H2S的去除率分別為78 %、63 %、77 %、71 %和68 %；既除氨和除硫的微生物有6株，對兩者去除率均達(dá) 60 %以上。由于時間與不同處理均可能對促腐過程中臭氣釋放量產(chǎn)生影響，因此，對數(shù)據(jù)進(jìn)行無重復(fù)雙因素方差分析，處理間差異極顯著(P<0.01)，處理為有效處理(圖7)。

2.5 除臭與促腐微生物的形態(tài)學(xué)鑒定

將經(jīng)過初篩、復(fù)篩和綜合除臭腐熟實驗驗證的具有除臭促腐功能的細(xì)菌和真菌分別采用簡單染色和無菌水制片方法進(jìn)行鏡檢，其中包括7種細(xì)菌和3種真菌(表3和圖8)。

表3 篩選后的除臭或促腐微生物培養(yǎng)生長特性及功能

續(xù)表3 Continued table 3

編號Number類型Type菌落形態(tài)Form菌落顏色Colour培養(yǎng)溫度(℃)Incubation temperature培養(yǎng)基Culture medium染色形態(tài)Dyeing form功能Function效果Effect11細(xì)菌呈酸奶狀乳白色30牛肉膏固體培養(yǎng)基由一長一短兩個桿狀組成促腐除硫除氨++++++++++12細(xì)菌表面微微凸起呈半圓狀白色30牛肉膏固體培養(yǎng)基芝麻狀促腐除氨++++++13細(xì)菌鼻涕狀中心略帶黃色整體無色透明30硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基由兩個細(xì)小橢圓桿狀組成除硫++

注：“++”表示有一定的促腐或除NH3或除H2S能力；“+++” 表示促腐或除NH3或除H2S能力較強(qiáng)； “++++” 表示有促腐或除NH3或除H2S能力顯著。

Note: ‘+ +’ indicates that there is a certain ability to promote or remove NH3or H2S; ‘+ +’ indicates that there is a strong ability to promote or remove NH3or H2S; ‘ + +’ indicates that there is a significant ability to promote or remove NH3or H2S.

4 討 論

優(yōu)化培養(yǎng)基及篩選條件是影響篩選效果的關(guān)鍵，試驗采用先建立耐氨、耐硫微生物庫的方法，通過初篩、復(fù)篩和綜合促腐效果驗證等步驟，從羊糞養(yǎng)殖蚯蚓后產(chǎn)生的蚓糞中分離和篩選高效促腐微生物，較常規(guī)篩選方法具有一定的科學(xué)性和可行性，縮小了篩選范圍，并取得了較好的篩選結(jié)果，為今后從各類畜禽糞便中篩選高效促腐除臭微生物具有一定的借鑒價值。溫度、pH值和GI值3項指標(biāo)是影響畜禽糞便腐熟發(fā)酵效果的重要因素[9]。試驗結(jié)果表明：添加微生物菌液各瓶中的溫度在腐熟發(fā)酵第18～24天和第34～36天變化幅度較大，均顯著高于空白和陰性對照組，與此期間添加微生物試驗組瓶內(nèi)pH值變化相吻合，說明添加的5種微生物參與瓶內(nèi)羊糞氨類復(fù)合物和有機(jī)酸合成與分解過程，并對瓶內(nèi)羊糞腐熟發(fā)酵過程中pH 值有一定調(diào)節(jié)功能；添加微生物的各處理瓶GI值均大于對照組，進(jìn)一步證明了在新鮮羊糞中添加適當(dāng)比例上述微生物能夠加速分解羊糞中的有害物質(zhì)，促進(jìn)腐熟進(jìn)程。進(jìn)一步結(jié)果表明，隨著添加微生物濃度的增加，羊糞發(fā)酵腐熟效果增強(qiáng)，且混合菌液較單一微生物菌液對羊糞促腐發(fā)酵效果顯著，說明以上5種微生物之間有一定的協(xié)同促腐作用。納氏試劑分光光度法與碘量法是檢測空氣或水體中氨、氮與H2S含量的一種靈敏且常用的方法[10-11]，試驗對除NH3和除H2S微生物的初步篩選采取不同的策略，由于H2S氣體不易制備和定量，試驗采用新鮮羊糞作為H2S氣體源進(jìn)行篩選，雖然存在一定的誤差，但最終在綜合效果驗證中得到證明。綜上所述，試驗從新鮮蚯蚓糞中篩選獲得10株對羊糞具有促腐和除臭功能的微生物，為了進(jìn)一步利用以上天然微生物促進(jìn)羊糞腐熟發(fā)酵及除臭，試驗已開展對上述微生物拮抗和組合功能試驗工作，并已取得相關(guān)進(jìn)展。

圖8 分離篩選的促腐與除臭微生物形態(tài)學(xué)染色觀察Fig.8 Morphological staining observation of microorganisms for promoting and deodorizing