王 謝，李星月，尹詩琳,3，唐 甜，張建華*

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066; 2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066; 3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 成都 611130)

【研究意義】桑輪紋病又稱桑輪斑病，是一種桑樹真菌病害，長期影響著亞洲諸國的蠶桑生產(chǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1980年，該病被Takahashi等[1]在日本首次報(bào)道，稱為zonate leaf spot of mulberry ，并指出該病的病原菌為“Gonatophragmiummori”。后Takahashi等[2]又調(diào)查指出其寄主涉及16科24屬 28植物種，完整描述了該病原菌的整個(gè)生活史階段。1999年，該病被Maji等[3]在印度發(fā)現(xiàn) ，稱為brown ring leaf spot disease of mulberry，并指出其病原菌為Cephalosporiumstrictum。我國從20世紀(jì)80年代開始對(duì)該病進(jìn)行報(bào)道研究，1994年首次正式報(bào)道了廣西百色蠶區(qū)發(fā)生的桑輪紋病災(zāi)情[4]，2007年江西修水縣爆發(fā)了桑輪紋病并呈較快的蔓延趨勢[5]，2011年浙江淳安縣也報(bào)道了一起特大桑輪斑病災(zāi)害事件[6]，2012年云南省昭通地區(qū)也首次報(bào)道了該地區(qū)出現(xiàn)的桑輪紋病[7]。2016年，筆者在四川眉山地區(qū)調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)桑輪紋病是當(dāng)?shù)孛磕瓯匕l(fā)生的一種病害，在隨后的兩年里，又在四川綿陽地區(qū)、四川仁壽地區(qū)、重慶潼南地區(qū)等地發(fā)現(xiàn)大面積桑樹輪紋病病害?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然桑輪紋病的傳統(tǒng)植物病理學(xué)研究已經(jīng)有了一定的基礎(chǔ)，但其具體的宿主-環(huán)境微生物-病原菌之間的關(guān)系研究尚處于空白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究試圖利用高通量測序分析技術(shù)探索桑輪紋病病斑內(nèi)部及周邊的真菌群落結(jié)構(gòu)，為未來進(jìn)一步揭示桑輪紋病的致病機(jī)理和構(gòu)建其綠色防治技術(shù)體系提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的前處理和采集

2017年10月31日，在青神桑輪紋病發(fā)病桑園中隨機(jī)選取10株發(fā)病桑樹，每株樹上取10片成熟的具有桑輪紋病病斑的桑葉，用95 %的乙醇將葉片表面消毒2次，再用無菌水沖洗2次，并用無菌濾紙拭干。然后，根據(jù)病斑在葉片上的空間位置劃分出病斑的核心區(qū)(簡稱H區(qū))、病斑的邊緣區(qū)(簡稱L區(qū))和病斑周圍的未發(fā)病區(qū)(簡稱N區(qū))3個(gè)特定區(qū)域(圖1)。其中，H區(qū)是指從外向內(nèi)第2圈層及其以內(nèi)的所有輪狀圈層所涉及的區(qū)域，顏色通常表現(xiàn)為枯黃色；L區(qū)是指最外層輪狀圈層(該層外半徑r1-內(nèi)半徑r0=距離a，顏色通常為棕色)及其相連的外半徑為(r1+ 1.5×a)的輪狀圈層(顏色通常為綠色)。N區(qū)是指與L區(qū)外緣相鄰的外半徑為(r1+

H: 病斑的核心區(qū); L: 病斑的邊緣區(qū); N: 病斑周圍的未發(fā)病區(qū); a: 距離H: Core area of lesion; L: Marginal area of lesion; N: Peripheral area of lesion; a: Distance圖1 桑輪紋病病斑特定取樣位置的設(shè)定Fig.1 Setting schematic of specific sampling location for mulberry ring sheath lesions

4.5×a)的輪狀圈層，顏色通常為綠色。接著，每片葉子取1個(gè)病斑，并在超凈工作臺(tái)下用手術(shù)剪刀分別剪下H區(qū)、L區(qū)和N區(qū)。最后，按照病斑的位置將剪下的H區(qū)、L區(qū)和N區(qū)分別混合為3個(gè)不同的待測樣品，用病斑位置的簡稱分別將樣品命名為H、L、N，并將其放入4 ℃冰箱中待測。

1.2 高通量宏基因組微生物測序的樣品處理

參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的使用說明書進(jìn)行DNA提取，提取DNA后進(jìn)行DNA完整性檢測。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的引物為已經(jīng)融合了Miseq測序平臺(tái)的ITS1-2通用引物。ITS1F引物為CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode) CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，ITS2R引物為GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。真菌PCR產(chǎn)物和其他擴(kuò)增片段小于400bp的PCR產(chǎn)物，選用0.8倍的磁珠處理。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1的等量混合后測序。等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測序濃度為20 pmol。該環(huán)節(jié)委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基于對(duì)reads數(shù)據(jù)的拼接、過濾、去嵌合及非特異性擴(kuò)增序列的數(shù)據(jù)前處理，分別進(jìn)行OTU聚類分析、Alpha多樣性分析、物種分類分析、多維度分析和物種分類樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序序列長度分析

質(zhì)量控制后，平均剩余序列52 205條，平均序列長度229.22 bp(表1)。

2.2 桑輪紋病病斑及周邊內(nèi)真菌的OTUs數(shù)

各樣品文庫的覆蓋率為0.99，表明樣本中序列沒有被測出的概率越低，本次測序結(jié)果可代表樣本的真實(shí)情況。在97 %的相似水平下，進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，共計(jì)比對(duì)1822個(gè)OTUs。其中，H區(qū)有604個(gè)OTUs，L區(qū)有499個(gè)OTUs，N區(qū)有974個(gè)OTUs。由圖2可知，H、L和N區(qū)3個(gè)區(qū)域內(nèi)的真菌存在明顯差異，其共有OTUs較少，而多為獨(dú)有的OTUs。

2.3 桑輪紋病病斑內(nèi)部及周邊的真菌群落結(jié)構(gòu)

經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)，除未鑒定的物種(圖3中的unclassified)外，在種水平上H區(qū)中相對(duì)豐度排名前5的真菌分別是Gonatophragmiumtriuniae、Myrotheciumroridum、Bannoahahajimensis、Incertaesedissp.和Hannaellaoryzae，其相對(duì)豐度分別為96.25 %、1.04 %、0.39 %、0.37 %和0.27 %；L區(qū)中相對(duì)豐度排名前5的真菌分別是Gonatophragmiumtriuniae、Myrotheciumroridum、Bannoahahajimensis、Strelitzianaalbiziae和Cercosporaapii，其相對(duì)豐度分別為96.95 %、0.48 %、0.13 %、0.13 %和0.09 %；N區(qū)中相對(duì)豐度排名前5的真菌分別是Gonatophragmiumtriuniae、Strelitzianaalbiziae、Chaetothyriaceaesp.、Myrotheciumroridum和Ascomycotasp.，其相對(duì)豐度分別為31.29 %、13.24 %、6.99 %、6.84 %和6.39 %。

表1 測序數(shù)據(jù)處理后的結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

圖2 桑輪紋病病斑特定取樣位置共有的和獨(dú)有的OTU數(shù)目Fig.2 Number of common and unique OTUs at specific sampling locations of mulberry ring sheath patches

2.4 桑輪紋病病斑內(nèi)部及周邊的真菌多樣性

H、L和N區(qū)的Shannon多樣性指數(shù)值分別為0.36、0.30和3.56，表明桑葉上病斑區(qū)內(nèi)生真菌多樣性低于周邊未發(fā)病區(qū)。

2.5 桑輪紋病病斑內(nèi)部及周邊的真菌之間相關(guān)性

將除未鑒定的物種(圖3中的unclassified)外，H、L和N區(qū)排名前5的真菌的相對(duì)豐度進(jìn)行泊松相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：病斑內(nèi)G.triuniae與B.hahajimensis、Incertaesedissp.、H.oryzae、S.albiziae、Chaetothyriaceaesp.、C.apii和Ascomycotasp.呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.97、-0.99、-0.83、-1.00、-1.00、-1.00和-1.00。而其他真菌之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)皆大于0.82。這表明桑輪紋病病斑的內(nèi)部及周邊真菌G.triuniae與其他真菌存在著激烈的競爭。

3 討 論

3.1 桑輪紋病的病原真菌有待進(jìn)一步確定

圖3 桑輪紋病病斑特定取樣位置的種水平上內(nèi)生真菌分布Fig.3 Endophytic fungi distribution at species level at specific sampling location of mulberry ring sheath disease

本研究中病斑H和L區(qū)相對(duì)豐度最大的真菌為G.triunia，而報(bào)道的桑輪紋病的病原真菌為G.mori[1]。鑒于發(fā)病樣品中檢測到的最大相對(duì)豐度真菌與傳統(tǒng)描述的病原真菌作為同屬真菌，且測得的病原真菌序列與文庫中G.triunia的序列比對(duì)相似度為100 %，在此，可初步認(rèn)為G.triunia為桑輪紋病的病原真菌。但必須注意的是，由于目前比對(duì)文庫中沒有G.mori的序列記載，加之高通量測序原理上存在不完整性，G.triunia與G.mori是否為同一個(gè)種，及兩者序列之間的差異到底有多大，這是尚未可知的。在尚未明確兩者是同一菌種的前提下，未來還需要進(jìn)一步分離桑輪紋病病原真菌并進(jìn)行遺傳鑒定。

3.2 桑輪紋病病斑的不斷擴(kuò)大與病原真菌的相對(duì)豐度密切相關(guān)

桑輪紋病病斑的不斷擴(kuò)大與病原真菌的相對(duì)豐度密切相關(guān)。在桑輪紋病病斑周圍N區(qū)中依然存在著31.29 %相對(duì)豐度的病原真菌(G.triunia)，這表明病斑的不斷增大與葉片內(nèi)病原真菌相對(duì)豐度的增加密切相關(guān)，且30 %的病原真菌相對(duì)豐度絕對(duì)不是其出現(xiàn)病斑的環(huán)境閾值。對(duì)比出現(xiàn)病斑的地方(L和H區(qū))，病原真菌的相對(duì)豐度都已經(jīng)達(dá)到了96 %以上。

3.3 桑輪紋病病斑內(nèi)病原真菌種群優(yōu)勢的建立主要依賴于植物毒素

病原真菌(G.triunia)在桑葉內(nèi)表現(xiàn)出明顯的競爭優(yōu)勢。Kinjo 等[8]于1987年研究發(fā)現(xiàn)桑輪紋病病原真菌可以釋放植物毒素，并對(duì)這些毒素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。這表明桑輪紋病病斑內(nèi)病原真菌種群優(yōu)勢的建立主要依賴于其釋放的植物毒素在真菌種群拮抗競爭過程中所起到的作用，所以它與其它主要真菌之間都呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3.4 桑輪紋病病斑中心穿孔可能與Myrothecium roridum有關(guān)

桑樹輪紋病發(fā)展到后期，中心會(huì)出現(xiàn)穿孔的現(xiàn)象。反觀在桑輪紋病病斑H區(qū)，真菌M.roridum的相對(duì)豐度比L區(qū)高；因此，研究猜測在真菌M.roridum會(huì)在病原真菌(G.triunia)利用完葉內(nèi)生長資源后對(duì)葉片進(jìn)行二次資源利用。經(jīng)觀察，H 區(qū)組病斑類似枯葉，微生物可利用的主要部分為葉表皮的角質(zhì)層。這表明了真菌M.roridum在進(jìn)行二次資源再利用時(shí)，需要對(duì)角質(zhì)蛋白具有明顯的可利用性。經(jīng)查，真菌M.roridum為桑樹漆斑病的病原菌[9-11]，其習(xí)性就是喜角質(zhì)蛋白[12]。真菌M.roridum的這一習(xí)性基本可以回答如此假設(shè)，即H區(qū)中心出現(xiàn)的穿孔是由M.roridum分解完葉表皮的角質(zhì)層后所留下的。雖然這需要更多的試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的論證，但這也暗示了桑輪紋病病斑形成機(jī)理的復(fù)雜性，從病原菌的附著到病斑的出現(xiàn)、再到擴(kuò)大和穿孔，整個(gè)過程涉及多種真菌的作用，這將為揭示桑輪紋病致病機(jī)理和研究綠色防控技術(shù)提供重要的參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

在種水平上桑輪紋病發(fā)病葉片的病斑核心區(qū)(H區(qū))、病斑邊緣區(qū)(L區(qū))和病斑周圍的未發(fā)病區(qū)(N區(qū))的真菌G.triuniae相對(duì)豐度排名皆是最高，分別為96.25 %、96.95 %和31.29 %。真菌M.roridum在H區(qū)的相對(duì)豐度為1.04 %，是L區(qū)的相對(duì)豐度2.17倍。該結(jié)果揭示了桑輪紋病病斑形成過程是復(fù)雜的，病斑的出現(xiàn)、擴(kuò)大和穿孔是多種真菌共同作用的結(jié)果。此外，研究結(jié)果還引出了桑輪紋病病原菌G.mori與數(shù)據(jù)庫100 %比對(duì)的真菌G.triuniae是否為同一種病原微生物需要進(jìn)一步確定的科學(xué)問題。