李 輝 龐建周 楊 超 李明星 張?chǎng)斡?李雪菲

（1 衡水學(xué)院濕地保護(hù)與研究中心 河北 衡水 053000；.河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所河北 衡水 053000；.衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

蚯蚓糞中含有大量的細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物，能夠吸收和降解排泄物中的惡臭成分。許多發(fā)達(dá)國(guó)家很早就已經(jīng)將蚯蚓糞應(yīng)用于惡臭的治理當(dāng)中[1、2]。本課題以新鮮蚯蚓糞為研究對(duì)象，利用蚯蚓糞除臭的特性，從蚯蚓糞中篩選出除臭菌，對(duì)得到的菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并分析，為今后研究除臭微生物菌劑的制備提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。新鮮的蚯蚓糞采集于周邊蚯蚓養(yǎng)殖基地。

1.2 培養(yǎng)基[3～6]。脫硫菌選擇培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏2 g，NaCl.g，Na2S·9H2O.g，蒸餾水1 000 ml；固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g/L。

除氨菌選擇培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，NaCl.g，(NH4)2SO40.6 g，K2HPO4.g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.05 g，蒸餾水1 L；固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g/L。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的富集和篩選[7～12]。將10.新鮮的蚯蚓糞分別加入到不同的液體選擇培養(yǎng)基中，震蕩30 min，于20℃恒溫箱培養(yǎng)5.得到富集菌液。將富集的菌液梯度稀釋，進(jìn)行初篩。用2%硼酸來(lái)吸收培養(yǎng)基中釋放的氨，用凱氏定氮法測(cè)氨的含量。用亞甲基藍(lán)分光光度法測(cè)定硫化氫，在665 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。

1.3.2 菌種的分子鑒定[13]。采用天根細(xì)菌基因提取試劑盒提取細(xì)菌基因，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。測(cè)序工作由北京賽默飛基因技術(shù)有限公司完成。將測(cè)定的基因序列進(jìn)行比較，與相似性較高的菌株序列進(jìn)行多重比較和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 除臭菌的篩選。從蚯蚓糞中共分離純化得到4 株菌株，分別命名為CC2、CC5、CC6、CC9，其中除氨菌3 株，分別為CC2、CC5、CC9；脫硫菌1 株，為CC6。

2.2 除臭菌的16SrRNA 基因序列分析。如圖1 所示，CC2 與Pseudomonas sp.的遺傳進(jìn)化距離最近，序列比對(duì)顯示二者16SrRNA 序列相似度達(dá)99.27%；與Pseudomonas aeruginosa的遺傳進(jìn)化距離較近，二者16SrRNA 序列相似度達(dá)99.2%，初步鑒定CC2 除臭菌屬于Pseudomonas sp.。

如圖2 所示，CC5與Bacillus subtilis的遺傳進(jìn)化距離最近，序列比對(duì)顯示二者16Sr-RNA 序列相似度達(dá)99.93%.與Bacillusvelezensis的遺傳進(jìn)化距離較近，二者16SrRNA 序列相似度達(dá)97.8%，初步鑒定CC5 除臭菌是Bacillus subtilis。CC6 與Bacillus icheniformis的遺傳進(jìn)化距離最近，序列比對(duì)顯示二者16SrRNA 序列相似度達(dá)99.97%；與Bacillus oryzaecorticis的遺傳進(jìn)化距離較近，二者16SrRNA 序列相似度達(dá)99.93%，初步鑒定CC6 除臭菌是Bacillus cheniformis。CC9 與Bacillus sp的遺傳進(jìn)化距離最近，序列比對(duì)顯示二者16SrRNA序列相似度達(dá)99.86%；與Bacillus thuringiensis的遺傳進(jìn)化距離較近，二者16SrRNA 序列相似度達(dá)99.65%，初步鑒定CC9 除臭菌屬于Bacillussp.。

圖1 CC2 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 CC5 菌株 CC6 菌株和CC9 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)僅對(duì)除臭菌進(jìn)行了初步篩選，共篩選得到4 株具有除臭效果的細(xì)菌：CC2、CC5、CC6 和CC9。其中CC2、CC5、CC9 是除氨菌，CC6 是脫硫菌。經(jīng)16SrDNA 分子鑒定可知：CC2 菌株是Pseudomonas sp.，CC5 菌株是Bacillus subtilis，CC6 菌株是Bacillus icheniformis，CC9 菌株是Bacillus sp.。目前，正在對(duì)這幾株菌的除臭效果進(jìn)行比較研究，并對(duì)這幾株菌的除臭條件進(jìn)行研究，為后續(xù)制備除臭菌劑提供理論基礎(chǔ)和理論依據(jù)。