李平 李瀟蒙 龍清孟

關鍵詞：貴州黑山羊;BMP15;SNPs;生物信息學

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）又稱生長分化因子9B，不僅能夠促進顆粒細胞分裂、分化，而且能夠抑制顆粒細胞中FSHR基因的表達[1]，同時能夠促進卵泡發(fā)育[6-7]。BMP15基因由1個內(nèi)含子與2個外顯子構(gòu)成，2個外顯子被內(nèi)含子隔開，外顯子全長1 176 bp，共編碼393個氨基酸殘基的前蛋白。通過大量研究發(fā)現(xiàn)，BMP15基因可能與高繁殖性狀有關，研究人員已在國內(nèi)優(yōu)良地方品種的綿羊上對BMP15基因展開相關研究，以期為構(gòu)建高繁殖力群體奠定基礎。目前，已在少數(shù)綿羊品種上發(fā)現(xiàn)BMP15基因與繁殖性狀有關聯(lián)，在小尾寒羊上發(fā)現(xiàn)BMP15基因B2處突變對高繁殖性狀影響作用十分明顯[4-5]。程俐芬等人研究發(fā)現(xiàn)BMP15基因在第一外顯子中雖存在突變位點，但對綿羊繁殖性狀并沒有顯著影響[3]。吳翠玲等研究6個綿羊群體發(fā)現(xiàn)，BMP15基因外顯子1上在58～60 bp處有3個堿基（CTT）缺失[1]。本研究通過PCR產(chǎn)物直接測序技術并結(jié)合生物軟件對貴州黑山羊BMP15基因進行多態(tài)性研究與生物信息學分析，預測mRNA二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)，以期為今后研究貴州黑山羊繁殖性狀提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血液DNA提取

102只貴州黑山羊血液樣本，來自冊亨縣冗渡鎮(zhèn)貴州領頭羊山地草牧業(yè)科技有限公司。血液DNA提取采用天根血液基因組DNA提取試劑盒，提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA進行檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)條帶清晰明亮、無RNA和蛋白質(zhì)等污染。通過微量紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之間，說明DNA提取效果好，純度高。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中綿羊BMP15基因序列（登錄號：NM_001114767.1）利用Primer 5.0軟件設計2對引物，其目的片段覆蓋全部外顯子區(qū)域，引物序列見表1。引物合成由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.3 PCR擴增

貴州黑山羊基因組DNA采用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取，以提取的DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為20.0 μL：PCR Mixture 10.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA2.0 μL，蒸餾水5.0 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，退火（退火溫度見表1）30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%;瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 PCR擴增產(chǎn)物測序和基因序列分析

PCR擴增產(chǎn)物，送往上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行雙向測序。測序結(jié)果利用SeqMan軟件進行序列分析，采用MWSnap測量SNPs等位基因的峰高值，根據(jù)Ai=Bi/（Ba+Bb），i=a，b公式估算各等位基因頻率。利用生物信息學軟件進行mRNA二級結(jié)構(gòu)預測，蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測結(jié)果

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對血液DNA進行檢測，電泳結(jié)果顯示基因組條帶整齊、清晰明亮、無RNA和蛋白質(zhì)等污染，并利用紫外分光光度計測量D260 nm/280 nm均在1.8～2.0范圍內(nèi)。檢測DNA結(jié)果表明提取的DNA可用于PCR擴增。

2.2 PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果

以5 μL擴增產(chǎn)物為樣本用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以1 000 bp DNA Ladder Maker作為分子量標記對照。檢測結(jié)果見圖1，PCR擴增產(chǎn)物條帶整齊、清晰明亮、檢測片段長度與目的片段一致，其擴增目的片段長度分別為632 bp和920 bp，表明2對引物的特異性較好。

2.3 擴增基因的測序

測序結(jié)果利用SeqMan軟件查看，找到1個SNP位點，由圖2可知，在第二外顯子6 260 bp處發(fā)生C→G突變，exon2-C 6 260 bp，利用DNAStar中的EditSeq軟件進行分析發(fā)現(xiàn)，BMP15基因編碼的蛋白質(zhì)突變前后發(fā)生改變，由Gln突變?yōu)镚lu，第二外顯子上的突變?yōu)殄e義突變。

2.4 SNPs等位基因頻率估算

BMP15基因SNPs等位基因的峰高值利用MWSnap軟件進行測量，將其測量值代入公式，利用公式估算出突變前后等位基因頻率，突變前為0.485，突變后為0.515，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示突變前后有差異。

2.5 BMP15基因mRNA二級結(jié)構(gòu)分析

利用EditSeq軟件進行mRNA二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，BMP15基因mRNA的序列在突變前后翻譯的氨基酸序列不同，使得mRNA結(jié)構(gòu)改變。利用http：//rna.tbi.univie.ac.at-bin/RNAfold.cgi軟件進行mRNA二級結(jié)構(gòu)預測，發(fā)現(xiàn)其突變前后的自由能均為-1 201.75 kJ/mol，突變前后具體的二級結(jié)構(gòu)見圖3。

2.6 BMP15的蛋白質(zhì)理化特性分析

依照BMP15基因所編碼的氨基酸序列，通過http：//us.expasy.org/tools/protparam.html在線進行蛋白質(zhì)理化特性分析。由表3可知，BMP15基因分子式突變前為C1828H2779N515O494S14，突變后為C1828H2778N514O495S14，在酵母菌中的半衰期突變前后均大于3 min，在人體外紅細胞中半衰期突變前后均大于2.8 h，該蛋白屬于不穩(wěn)定性蛋白。利用Antheprot 63分析軟件對BMP15蛋白的親水性和易溶性進行分析，由圖4、圖5可知，BMP15蛋白的親水指數(shù)范圍為-1.91～2.72;易溶性較強，皆為正數(shù)，最大易溶性為3.97。綜上分析，BMP15蛋白整體上表現(xiàn)為親水性。利用在線跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫對BMP15的跨膜區(qū)域進行分析，由圖6可知，實線表示跨膜方向由膜內(nèi)向膜外，虛線表示跨膜方向膜外向膜內(nèi)，2種跨膜方向皆是由正數(shù)到負數(shù)再到正數(shù)的順序，此蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)。

2.7 BMP15蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

https：//npsa-pr-abi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_Sopma.html網(wǎng)頁在線進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測;結(jié)果顯示，α-螺旋（Alpha helix）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）、擴展鏈、 無規(guī)卷曲在突變位點前后均有改變（表4）。利用Protean軟件對BMP15蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預測（圖7）。

2.8 BMP15蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index網(wǎng)頁在線進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測，分析顯示突變前和突變后的變化具體結(jié)構(gòu)，見圖8。

3 討論

近年，研究人員不斷地挖掘BMP15基因突變位點[8-9]，并且有研究發(fā)現(xiàn)BMP15基因是控制綿羊高繁殖性狀的主效基因之一[10-11]，目前已在Inverdale綿羊、Hanna綿羊和Lacaune綿羊等國外品種中發(fā)現(xiàn)BMP15基因與產(chǎn)羔性狀相關的多個不同突變位點[15]。田志龍等人在綿羊上對BMP15基因進行多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)g.50971423T > C位點處存在3種基因型，分別是TT、TC和CC，在單羔和多羔品種間其基因型頻率和等位基因頻率均差異顯著（P<0.05）[12]。胡珊等對山羊BMP15基因進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)山羊BMP15基因編碼區(qū)長 1 185 bp，編碼394個氨基酸，BMP15蛋白是一個具有親水性的不穩(wěn)定的堿性蛋白[2]。何遠清等在6個山羊品種中找到了B4突變[13]，林尖兵等也在貴州白山羊中找到了B4突變[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)貴州黑山羊BMP15基因在第二外顯子6 260 bp處發(fā)生C→G突變。朱韶華等研究發(fā)現(xiàn)BMP15第二外顯子第755位點發(fā)生的T→C突變（AC型）對蒙古羊1胎產(chǎn)雙羔影響十分顯著[16]。通過生物信息學分析，結(jié)果顯示，BMP15基因突變前后所編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，此突變?yōu)殄e義突

變;BMP15蛋白為具有跨膜結(jié)構(gòu)的親水性不穩(wěn)定性蛋白。胡珊等研究發(fā)現(xiàn)，BMP15蛋白是一個不穩(wěn)定的堿性蛋白[2]。本研究在BMP15基因上也有同樣的發(fā)現(xiàn)。有研究表示，BMP15第二外顯子的突變可能與動物繁殖性狀相關，本研究在第二外顯子上找到突變位點，后續(xù)將結(jié)合第二外顯子突變與繁殖性狀作進一步的研究，以期為今后與性狀相關聯(lián)研究提供理論依據(jù)。

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