楊 靜，霍玉青

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 濱州 256600)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅著婦女的健康。在常見惡性腫瘤中宮頸癌的發(fā)病率位居第三位，在婦科惡性腫瘤中其死亡率位居第四位。據(jù)全球范圍統(tǒng)計，每年約有47.1萬新發(fā)病例，21.5萬死亡病例。我國每十萬婦女中有12.96人患宮頸癌，3.28人死于宮頸癌[1]。80%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國家，且發(fā)病年齡年輕化給婦女健康帶來嚴重影響。

蛋白質(zhì)泛素化是一個可逆的過程。一些蛋白質(zhì)家族具有去泛素化的活性，其中包括卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)家族、泛素特異蛋白酶(USP)家族和泛素C端水解酶(UCH)家族等[2]。OTUD5(OTU domain-containing protein 5 )屬于含有OTU結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸蛋白酶超家族。OUT結(jié)構(gòu)域能介導去泛素化酶活性，OTUD5能通過去除的K63多聚泛素鏈泛素化抑制I型干擾素的產(chǎn)生[3]。但目前其在宮頸癌中的表達及意義尚不明確。

1 資料與方法

1.1臨床標本免疫組化檢測及結(jié)果判定：收集60例行根治性手術(shù)治療的宮頸癌患者病理標本，所有標本均經(jīng)病理學證實。兔抗人OTUD5單克隆抗體購于Novus公司。過氧化酶標記的鏈酶卵白素(streptavidin-perosidase，SP)免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德公司。采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果，以出現(xiàn)棕色顆粒作為陽性標準。將“-”定義為陰性表達，“+”及“++”定義為低表達，“+++”定義為高表達。低表達和高表達為陽性表達。

1.2細胞和試劑：使用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從組織中分離總RNA。 使用轉(zhuǎn)錄物第一鏈cDNA合成試劑盒(Roche，Mannheim，Germany)合成cDNA。 實時PCR由Faststart Universal SYBR Green Master(Roche)進行。OTUD5正向物：GAAGTAGATGTGGCACCATT，反向引物：CATTCCCACCACAGAAGACC。

1.3細胞和試劑：宮頸癌Hela細胞系購自中國科學院上海細胞庫，使用低糖DMEM加10%胎牛血清( FBS)進行細胞培養(yǎng)、傳代、凍存等，用于實驗的細胞無支原體污染，狀態(tài)良好。OTUD5過表達質(zhì)粒購自山東維珍生物公司。

1.4細胞培養(yǎng)和實驗分組：細胞經(jīng)RIPA裂解細胞后,4 ℃低溫離心機中離心(12 000×g，5 min)，提取總蛋白，BCA法蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。制備相應濃度SD-PAGE凝膠，將蛋白加入凝膠孔中(相應加入Maker)后進行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，洗滌后BSA封閉，先后加入一抗二抗孵育，加入發(fā)光液，曝光、洗片，掃描并分析。

1.5CCK-8細胞增殖實驗：35 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)Hela細胞，待細胞融合度至80%，以每孔2 000個細胞均勻鋪于96孔板，每組設6個復孔，分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，棄去96孔板內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100 μl用培養(yǎng)基稀釋好的CCK-8溶液(1∶10)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，使用多功能酶標儀檢測450 nm處的吸光值( A)。計算各時間點A值變化倍數(shù)，用以表示細胞增殖倍數(shù)，增殖倍數(shù)= A ( x h) /A ( 0 h)，x = 0、24、48、72、96。

1.6Western blotting檢測：Hela細胞棄培養(yǎng)基后用預冷的生理鹽水沖洗，加入RIPA蛋白裂解液，離心20 min，取上清到EP管中，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。蛋白溶液使用SDS-PAGE電泳分離全蛋白樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，按說明書比例稀釋一抗及內(nèi)參GAPDH，最后充分洗膜完成后，進行定量分析，以光密度值(OD) 表示。

2 結(jié)果

2.1OTUD5在宮頸癌組織及癌旁組織的表達：全組患者病理標本經(jīng)免疫組化檢測，OTUD5陽性表達主要著色于細胞漿。在全組60例宮頸癌組織標本中，陰性表達20例，弱陽性17例，中度陽性14例，強陽性9例，高表達率為38.3%(23/60)；在癌旁組織中，陰性表達21例，弱陽性26例，中度陽性8例，強陽性5例，高表達率為21.7%(13/60)。兩組之間行χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.968，P=0.046)。見表1。

表1 OTUD5在宮頸癌及癌旁組織中的表達[例(%)]

位置例數(shù)OTUD5表達高表達 低表達χ2值P值癌組織6023(38.33)37(61.67)3.9680.046癌旁組織6013(21.67)47(78.33)

2.2RT-PCR技術(shù)檢測OTUD5在宮頸癌組織及癌旁組織的表達：為了明確宮頸癌及癌旁組織OTUD5 mRNA表達情況，我們選取10例新鮮手術(shù)切除標本為研究對象。分別提取RNA并進行qRT-PCR。結(jié)果如圖1所示，癌組織中OTUD5 mRNA表達水平明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3OTUD5過表達Hela細胞系的建立：應用慢病毒包裝技術(shù)構(gòu)建過表達OTUD5的Hela細胞系。使用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后OTUD5蛋白水平的變化。結(jié)果如圖2所示，pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)OTUD5蛋白相對表達水平為0.435±0.048，pcDNA3.1- OTUD5轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)OTUD5蛋白相對表達水平為0.224±0.139，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.162，P=0.012)。

圖1 OTUD5 mRNA表達在宮頸癌及癌旁組織的比較

圖2 OTUD5過表達前后宮頸癌細胞系Hela中OTUD5蛋白的相對表達量

2.4OTUD5過表達對Hela細胞增殖和克隆能力的影響：為了明確OTUD5過表達后Hela細胞增殖有無改變，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細胞為對照組，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- OTUD5的細胞為實驗組，分別培養(yǎng)48 h，應用CCK-8法檢測0 h、12 h、24 h、36 h、72 h、5 d、7 d各樣本吸光度值(OD 570 nm)。如圖3A所示。兩組間細胞增殖率在24 h后出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P<0.05)，持續(xù)至7 d。平板克隆實驗顯示，OTUD5過表達后Hela細胞的克隆增長能力明顯增強(見圖3B、C)，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 A：OTUD5過表達后Hela細胞增殖能力比較；B,C：OTUD5過表達后Hela細胞平板克隆能力比較

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病趨勢有年輕化趨向，且近些年腺癌的類型明顯增加，嚴重危害女性的健康。雖然宮頸癌發(fā)病的諸多誘因已得到證實，但其在基因水平的變化尚未完全明了。有研究表明，泛素化的發(fā)生在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要的作用，被證實參與了從正常細胞向癌細胞的轉(zhuǎn)化、癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，對宮頸癌患者的預后產(chǎn)生重要的影響[4-7]。

泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式。盡管蛋白質(zhì)的泛素化通常導致蛋白的降解，但蛋白質(zhì)泛素化也能導致信號通路的活化或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運[8-10]。比如，賴氨酸48(K48)位點的多聚泛素化鏈能導致蛋白質(zhì)的降解，而賴氨酸63(K63)位點的多聚泛素化鏈對于細胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運具有重要的意義。OTUD5屬于含有OTU結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸蛋白酶超家族，OUT結(jié)構(gòu)域能介導去泛素化酶活性[11]。2007年有報道OTUD5能通過去除TRAF3的K63多聚泛素鏈泛素化從而抑制I型干擾素的產(chǎn)生[12]。因此，合理猜測OTUD5可能通過去除Akt的K63位點多聚泛素化，減少Akt的細胞膜轉(zhuǎn)移，降低其T308位點的磷酸化，并抑制Akt的活性，從而減少由于Akt高度活化導致的宮頸癌放療耐受。本研究中我們發(fā)現(xiàn)OTUD5在宮頸癌組織中表達高于癌旁正常組織，進一步通過構(gòu)建過表達OTUD5的細胞系發(fā)現(xiàn)，過表達OTUD5的Hela細胞系增殖及侵襲活性明顯增強，從而說明上調(diào)OTUD5的表達可以促進宮頸癌Hela細胞的增殖及侵襲能力。

本研究雖然從RAN及蛋白水平發(fā)現(xiàn)了OTUD5在宮頸癌中的表達情況，但仍停留在現(xiàn)象層面，未能從分子水平對其作用機制進一步證實，且樣本量相對較少，尚需進一步研究證實。