王婭婭 李 娜 曾鍵堯 孫津歌 姚 潔 王 妍 楊 琳

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院天津市動植物抗性重點實驗室 天津 300387）

20世紀(jì)80年代，Boman研究小組用蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）誘導(dǎo)惜古比天蠶（Hyalophora cecropia）后產(chǎn)生了抗菌多肽類物質(zhì)，隨后發(fā)現(xiàn)了第1個抗菌肽——天蠶素（cecropins）?？咕模╝ntibacterial peptides）廣義上是指由生物基因組編碼的，具有對抗外源性微生物侵害、清除體內(nèi)病變細(xì)胞功能的一類小分子多肽，被認(rèn)為是從細(xì)菌到昆蟲、動物乃至人體內(nèi)普遍存在的一類防御性肽類活性物質(zhì)，又被稱為“第二防御體系”［1］?？咕囊话阌?0～50個氨基酸殘基組成，可根據(jù)其氨基酸組成、大小和構(gòu)象結(jié)構(gòu)進行劃分。從結(jié)構(gòu)上分析，抗菌肽可分為四大類：β-折疊、α-螺旋、環(huán)狀肽和延伸擴展肽。大多數(shù)抗菌肽的抗菌結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主?？咕膽?yīng)用極廣，作為治療手段已發(fā)展到臨床前和臨床試驗階段，作為抗菌添加劑和防腐劑也已應(yīng)用到食品工業(yè)、飼料加工業(yè)、輕工業(yè)等方面［2］。

1 抗菌肽的來源

1.1 植物抗菌肽 植物是具有藥理作用的多種分子的主要來源。植物抗菌肽是進化最古老的天然免疫成分之一，是宿主抵御病原體攻擊的第一道防線。植物產(chǎn)生小的富含半胱氨酸的抗菌肽作為一種自然防御機制，該防御機制可能是組成性表達或誘導(dǎo)宿主對病原體攻擊的反應(yīng)［3］。從植物中分離的抗菌肽同樣具有很強的抗真菌和抗細(xì)菌活性，并且從菠菜葉粗細(xì)胞壁中分離得到的抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的病原菌均有一定的拮抗作用，對真菌例如鐮刀菌、梭菌、美氏雙星菌和赤炭疽桿菌也有一定的拮抗作用［4］。

1.2 昆蟲抗菌肽 昆蟲抗菌肽是昆蟲在受到刺激或感染之后在其血淋巴中產(chǎn)生的一種抗菌類物質(zhì)，是一類重要的昆蟲先天免疫效應(yīng)物質(zhì)。昆蟲抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定性強、水溶性好、無免疫原性、強堿性、抗菌譜廣等特點。昆蟲抗菌肽不僅對細(xì)菌和真菌有廣譜殺滅作用，而且對病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有殺傷作用［5］。抗菌肽的集體劑量是抗藥性的主要決定因素，單個抗菌肽基因在自然選擇壓力下受到的影響很小。但Unckless R.L.等在果蠅中進行的2項研究表明，敲除單個或少量的抗菌肽基因可能會對機體對細(xì)菌感染的抵抗力產(chǎn)生重大影響。在Diptericin基因中，單個氨基酸多態(tài)性對抗性具有較強的預(yù)測作用，說明自然選擇可有效作用于單個抗菌肽基因［6］。從結(jié)構(gòu)特征上主要分為五大類：天蠶素類、昆蟲防御素類、富含甘氨酸的抗菌肽、富含蛋白質(zhì)的抗菌肽及溶菌 酶［7］。

1.3 兩棲動物抗菌肽 兩棲動物是一種古老的生物，它們的免疫系統(tǒng)高度進化。兩棲動物抗菌肽是在一個單一物種的皮膚上合成的。兩棲動物皮膚在自然進化過程中形成了防御病原微生物的3套防御系統(tǒng),相應(yīng)地具有特定結(jié)構(gòu)。皮膚抗菌肽是其中先天性防御系統(tǒng)的主要組成部分［8］。其中兩棲動物（青蛙和蟾蜍）的皮膚是抗菌肽非常豐富的來源。生物界中已成功分離750多種抗菌肽,其中具有抗腫瘤活性的約占13.1%,源于兩棲動物的占13.3%［9］。

1.4 哺乳動物抗菌肽 動物的粘膜層覆蓋并保護所有上皮組織免受微生物、機械和化學(xué)物質(zhì)的侵害，形成最初的防線。主要成分是粘蛋白和其他糖蛋白、蛋白酶抑制劑和陽離子肽［10］。哺乳動物陽離子抗菌肽的廣譜抗菌性有效地防止動物受到微生物的危害。人類的皮膚中也含有抗菌肽，主要由角質(zhì)形成細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、皮脂細(xì)胞或汗腺產(chǎn)生，在炎癥刺激后或構(gòu)成性表達［11］。在人類和其他哺乳動物中，完全處理過的活性肽可從干燥皮膚和舌頭的角質(zhì)化上皮片中分離得到［12］。

1.5 魚類抗菌肽 魚類是水生動物的主要組成部分。與其他生物一樣，魚類也分泌不同種類的抗菌肽，這些抗菌肽是一種帶正電荷的短氨基酸鏈分子，參與宿主的防御機制。魚類抗菌肽不僅表達了所有主要的抗菌肽類，包括防御素、抗菌肽、hepcidin、組織衍生肽，以及一種稱為piscidin的cecropin家族的魚特異性肽，而且有極高的耐鹽 性［13］。

1.6 微生物抗菌肽 微生物產(chǎn)生抗菌肽保護其環(huán)境生態(tài)位。微生物產(chǎn)生的抗菌肽，包括通過核糖體合成的小細(xì)菌素和真菌防御素，以及通過非核糖體合成的次生代謝產(chǎn)物肽、環(huán)肽和偽肽［14］。

2 抗菌肽的作用機制

自抗菌肽被發(fā)現(xiàn)起，其作用機制得到了廣泛的研究。一些研究表明，抗菌肽通過胞膜滲透作用，與細(xì)胞膜結(jié)合，破壞其完整性而殺死細(xì)菌；還有研究表明，抗菌肽通過胞膜進入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，然后作用于特定的靶點殺死細(xì)菌?？咕闹嘘栯x子居多，大多陽離子抗菌肽的作用機制都是通過胞膜滲透作用，本文將從膜滲透機制闡述抗菌肽抗菌的作用機制。

2.1 初始的靜電相互作用 人們普遍認(rèn)為細(xì)胞質(zhì)膜是抗菌肽的主要目標(biāo)，大量實驗數(shù)據(jù)也表明，抗菌肽主要是通過與磷脂組分的相互作用破壞細(xì)胞膜的完整性［15］。大多數(shù)抗菌肽是陽離子的，同時具有雙親性。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，質(zhì)膜的外膜含有朝向細(xì)胞外的陰離子分子，陽離子抗菌肽將優(yōu)先與暴露在外的陰離子結(jié)合［16］。肽段通過疏水相互作用插入外膜結(jié)構(gòu)，并可能包括肽段預(yù)折疊成膜相關(guān)結(jié)構(gòu)；這導(dǎo)致了外膜結(jié)構(gòu)的紊亂，并在一個稱為自我促進吸收的過程中使該膜滲透到其他肽分子。最終的結(jié)果是肽到達細(xì)胞膜，在靜電和疏水相互作用的驅(qū)動下，肽進入膜的界面區(qū)域，肽膜積累使膜滲透率增加和膜屏障功能喪失，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)組件滲漏和細(xì)胞死亡［17］。

2.2 濃度閾值 在最初的膜結(jié)合之后的某個時刻，肽進入了膜相互作用的第二階段，通常稱為閾值濃度。在此階段，肽開始通過一些可能的機制進入和穿過脂質(zhì)雙層膜，最終將其抗菌作用擴展到內(nèi)質(zhì)膜。從概念上講，驅(qū)動這類事件所必需的閾值濃度是由目標(biāo)表面肽的積累造成的。可能影響這一閾值的參數(shù)包括肽濃度、自組裝或多聚的傾向，以及磷脂膜的組成和流動性等；此外，需要注意的是，肽膜之間的相互作用可能因肽的構(gòu)象動力學(xué)或靶膜重構(gòu)而異［18］。當(dāng)抗菌肽的濃度高于臨界濃度時抗性更廣，例如抗菌肽protegrin-1是針對陰離子膜的，但Lam K.等［19］的研究表明，在足夠高的肽濃度下，它對兩性離子膜也具有破壞性。

2.3 破壞菌膜完整性 抗菌肽在表面積累，達到一定濃度后在細(xì)菌膜上自組裝。形成的模型可分為二大類：跨膜孔隙模型和非孔隙模型?？缒た紫赌Ｐ涂蛇M一步細(xì)分為桶壁孔隙模型和環(huán)狀孔隙模型。在桶壁模型中，最初抗菌肽與膜平行，肽膜結(jié)合后，可能發(fā)生構(gòu)象改變，迫使極性磷脂頭基團側(cè)移，誘導(dǎo)局部膜變薄；當(dāng)結(jié)合肽達到閾值濃度時，垂直插入脂雙層中，但脂類的疏水和親水性排列得以維持，以一種類似于膜蛋白離子通道的方式（圖1a）。在環(huán)狀孔隙模型中，肽段也垂直插入脂質(zhì)雙分子層，但不存在特定的肽-肽相互作用,抗菌肽螺旋插入膜內(nèi)，誘導(dǎo)脂質(zhì)單層膜通過孔不斷彎曲。在形成環(huán)狀孔時，肽的極性面與脂類的極性頭基團相聯(lián)系，其孔隙部分由肽段形成，部分由磷脂頭群形成，雙層的疏水和親水性排列被破壞（圖1b）。這2種成孔模型都會導(dǎo)致膜去極化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［20-21］。抗菌肽也可在不形成膜上特定孔隙的情況下起作用。其中一個模型被稱為地毯模型（圖1c），在地毯模型中，抗菌肽與脂質(zhì)雙分子層平行吸附，達到閾值濃度覆蓋膜表面，從而形成“地毯”，產(chǎn)生一種類似清潔劑的效果，最終通過形成膠束分解膜，膜完整性喪失，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［21-22］。

圖1 抗菌肽破壞膜的3種機制（參照Giuliani A.等［15］）

除了上述所描述的作用機制外，還有一些研究表明，抗菌肽作用機制還可通過胞膜靜電作用進入細(xì)胞中，作用于線粒體、核苷酸、蛋白等殺死細(xì)菌，抗菌肽的作用機制一直在持續(xù)研究并不斷完善。

3 抗菌肽的應(yīng)用

因為抗菌肽具有廣普抗菌活性、不易產(chǎn)生耐藥微生物、無污染等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到食品業(yè)、臨床治療、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)等方面。

3.1 在醫(yī)療中的應(yīng)用 細(xì)菌對抗生素的耐藥性已成為威脅生命的、與細(xì)菌感染有關(guān)的全球性問題。耐藥細(xì)菌引起的嚴(yán)重問題迫切需要發(fā)展替代療法。抗菌肽被認(rèn)為是生產(chǎn)新一代抗生素、有前途的抗菌藥物。此外，抗菌肽的原子水平結(jié)構(gòu)是產(chǎn)生改良肽抗生素候選體的先決條件?？咕目砷_發(fā)作為藥物，例如Pexiganan是magainin 2的合成變體，作為一種新型廣譜外用抗生素已進入臨床試驗，用于治療輕至中度糖尿病足潰瘍感染［23］?？咕淖鳛樾滦涂股爻呶?，但由于肽類抗生素具有潛在的細(xì)胞毒性，還不能應(yīng)用。抗菌肽治療的發(fā)展還存在障礙，包括潛在的細(xì)胞毒性、免疫原性和過敏性副作用，以及大規(guī)模生產(chǎn)的高成本［24］。這也是抗菌肽類藥物不能在醫(yī)療上廣泛應(yīng)用的原因。雖然在臨床應(yīng)用方面還有一些障礙需要克服，但天然和合成的抗菌肽對制藥公司來說仍具有吸引力。

3.2 在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用 由病毒、細(xì)菌和真菌引起的植物病害影響作物，并降低了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和安全，對作物造成了重大損失。為了減少產(chǎn)量損失，迫切需要開發(fā)新的育種策略。農(nóng)藥和殺蟲劑通常對殺死植物微生物有高效性，但其廣泛使用造成了環(huán)境的化學(xué)污染，并且會對植物產(chǎn)量造成巨大的損失?；蚬こ淌情_發(fā)抗病種質(zhì)、提高產(chǎn)量、減少損失的有效策略。通過轉(zhuǎn)入抗菌肽的基因，使其在植物中表達，可對病害進行防治。目前，不同來源的抗菌肽已被證明能在一系列基因工程植物中對真菌和病原菌產(chǎn)生耐藥性，包括擬南芥、煙草、卷心菜、大米和番茄等。植物中抗菌肽的開發(fā)不僅限于大田作物，樹木也被抗破壞性病原體的抗菌肽編碼基因轉(zhuǎn)化，例如，轉(zhuǎn)基因蘋果、香蕉、梨和葡萄均對其常見疾病產(chǎn)生了顯著的抗性；轉(zhuǎn)基因楊樹明顯減輕了樹皮壞死、樹皮潰瘍等癥狀［25］。

3.3 在禽畜飼養(yǎng)中的應(yīng)用 抗菌肽在禽畜中的應(yīng)用是作為飼料添加劑，可增強禽畜的免疫力，促進增長和預(yù)防傳染?。?6］。Liu Q.等［27］已通過實驗驗證，在飼料中添加抗菌肽（重組豬防御素與蒼蠅抗菌肽混合比例為1∶1）可提高斷奶仔豬的生長發(fā)育和免疫力。

3.4 在食品中的應(yīng)用 食品安全是食品工業(yè)和消費者共同關(guān)心的重大問題。食品工業(yè)正面臨著技術(shù)挑戰(zhàn)，因為人們越來越關(guān)注化學(xué)防腐劑的使用，對更天然、加工程度更低的食品的需求也越來越大。生物保鮮劑技術(shù)被認(rèn)為是一個很有前景的研究方向。食品的生物保藏技術(shù)是在一定程度上抑制食品污染的生態(tài)友好途徑。天然抗菌肽應(yīng)用于食物防腐劑中現(xiàn)已成為關(guān)注的熱點［28］。

實際上，抗菌肽已應(yīng)用于食品保鮮，nisin便是一種被廣泛應(yīng)用于食品保鮮的抗菌肽。它被用作天然的奶酪防腐劑以延長酸奶的保質(zhì)期，能抑制食物腐敗，保持酸奶的風(fēng)味和香氣；也可用于罐頭食品中，防止嗜熱微生物的破壞。抗菌肽不僅可單獨使用，也可與其他抗菌藥物、精油和聚合物納米顆粒結(jié)合使用，以提高食品的保質(zhì)期［29］。

抗菌肽在對抗致病菌和非致病菌引起的食物腐敗和中毒方面也有潛在的治療作用。Kraszewska J.等的研究確定人-β防御素3（HBD3）作為一種有效的抗菌劑，可大量破壞啤酒中的細(xì)菌。因此，HBD3是一個很好的防止食品和飲料變質(zhì)的添加劑，以防止食品和飲料腐?。?0］。目前，只有nisin被國際上批準(zhǔn)用于食品安全保存。雖然抗菌肽在食品保鮮方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但要解決食品變質(zhì)問題，還需要進行研究。因此，迫切需要開發(fā)新型抗菌肽。

4 總結(jié)

抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，體積小，無污染，不易產(chǎn)生耐藥性，在抗生素濫用的情況下，是作為抗生素潛在替代品的優(yōu)先選擇?？咕牡膩碓磸V泛，在植物、兩棲動物、哺乳動物、微生物中都有廣泛的來源。現(xiàn)今的研究中已有上百種抗菌肽被發(fā)現(xiàn)并成功分離。抗菌肽也被應(yīng)用到農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、禽畜和食品等中，應(yīng)用前景非常樂觀。但因抗菌肽的毒性和高成本，并沒有在各個領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。相信隨著科學(xué)技術(shù)的進步和研究的不斷深入，抗菌肽的問題會逐步解決，并得到很好的應(yīng)用。