楊樹法 李嘉琪 王天鐸 司艷梅 劉 欣

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，北京 100026;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)系，北京 100069)

出生缺陷是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，為社會(huì)和患者家庭帶來了沉重的家庭負(fù)擔(dān)。遺傳性因素導(dǎo)致的出生缺陷占70%左右，染色體畸形是最常見的遺傳因素[1]。通過產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷，降低此類新生兒出生是減輕社會(huì)和患兒家庭負(fù)擔(dān)的有效途徑。

免疫熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization， FISH)利用熒光標(biāo)記探針可以對(duì)21三體、18三體、13三體以及性染色體非整倍體等常見染色體畸形進(jìn)行快速檢測(cè)[2]。研究[3]顯示上述常見染色體畸形占到產(chǎn)前診斷中染色體畸形的50%左右，這些染色畸形均可以通過FISH進(jìn)行檢測(cè)。與染色體核型分析相比，F(xiàn)ISH不需要細(xì)胞培養(yǎng)過程，最快24 h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，能夠?yàn)樵袐D和臨床醫(yī)生采取進(jìn)一步措施爭(zhēng)取時(shí)間，有效緩解孕婦焦慮。本研究利用FISH和傳統(tǒng)染色體核型分析的檢測(cè)方法對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，探討其在快速診斷羊水染色體異常中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年6月至2017年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行羊水穿刺的孕婦為研究對(duì)象1 676例。行FISH檢測(cè)，孕婦平均年齡為(31.00±4.32)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①羊水穿刺后同時(shí)進(jìn)行FISH檢測(cè)和染色體核型分析。②羊水標(biāo)本為非血性標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：FISH檢測(cè)和染色體核型分析中有一個(gè)或者兩者實(shí)驗(yàn)失敗。

1.2 FISH檢測(cè)

1)胰蛋白消化:羊水離心獲得羊水細(xì)胞后，經(jīng)0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶37 ℃消化20 min，期間用力吹打細(xì)胞。用吸管將消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min。

2)低滲：將消化后的羊水離心棄掉上清后，加入6 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))枸櫞酸鈉低滲液，混勻后37 ℃水浴中孵育12 min。

3)固定：向低滲后的細(xì)胞中加入1 mL固定液(甲醇與無水乙酸3∶1混合)，混勻后離心棄上清；向沉淀中加入5 mL固定液，混勻后離心棄上清，重復(fù)2次。

4)制片：調(diào)節(jié)固定后細(xì)胞濃度并滴片。將制備好的玻璃片56～60 ℃老化2 h。

5)胃蛋白消化：將老化后的載玻片轉(zhuǎn)移到含有1%(體積分?jǐn)?shù))甲醛PBS中，室溫固定2 min。然后放入新鮮配制的0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胃蛋白酶中，37 ℃孵育13 min。

6)原位雜交：將載玻片依次浸泡在70%、85%、100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中進(jìn)行脫水處理后，將7 μL FISH探針雜交液(美國(guó)雅培公司)點(diǎn)樣到相應(yīng)區(qū)域。用蓋玻片覆蓋反應(yīng)區(qū)并用中性樹膠封閉蓋玻片，然后77 ℃，變性5 min；37 ℃雜交12 h。

7)洗脫及封片: 用鑷子去除封片樹膠，73 ℃ 0.4×檸檬酸鈉緩沖液(saline sodium citrate，SSC)/0.3%(體積分?jǐn)?shù))NP-40孵育 2 min，2×SSC/0.1%(體積分?jǐn)?shù))NP-40室溫1 min。依次浸泡在70%、85%、100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中進(jìn)行脫水處理后，滴加10 μL 含有DAPI的封片劑。避光-20 ℃保存20 min后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

8)結(jié)果判讀：隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，異常細(xì)胞比例小于10%，正常細(xì)胞90%，判斷為正常。異常細(xì)胞比例≥10%判斷為異常(異常比例在10%～60%間判定為嵌合)。

1.3 染色體核型分析

1)培養(yǎng):羊水離心獲得羊水細(xì)胞后，接種入羊水全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后換液，換液后2～3 d觀察羊水細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

2)消化：向待收獲的培養(yǎng)瓶中加入100 ng/mL秋水仙素培養(yǎng)50 min后，加入0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化。

3)低滲：將消化后的羊水離心棄掉上清后，加入6 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))枸櫞酸鈉低滲液，混勻后37 ℃ 水浴中孵育12 min。

4)固定：向低滲后的細(xì)胞中加入1 mL固定液(甲醇與無水乙酸3∶1混合)，混勻后離心棄上清；向沉淀中加入5 mL固定液，混勻后離心棄上清，重復(fù)2次。

5)制片及染色：調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，滴片。制備好的玻璃片56～60 ℃ 2 h。然后經(jīng)胰蛋白酶消化和吉姆薩染色后，制成染色體標(biāo)本

6)核型分析：按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN)2016》[4]，計(jì)數(shù)25個(gè)細(xì)胞，分析5個(gè)核型，由具備產(chǎn)前診斷資質(zhì)人員出具診斷報(bào)告。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況

2013年6月至2016年12月間共收集1 676例FISH檢測(cè)，進(jìn)行FISH檢測(cè)的指征包括：孕婦高齡、唐氏篩查高危、無創(chuàng)游離DNA檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)、B超異常以及其他，詳見表1。

表1 孕婦羊水穿刺指征

AMA:advanced maternal age;MSS:positive result of maternal serum screening;cffDNA:high risk of cell-free fetal DNA testing.

2.2 羊水細(xì)胞FISH檢測(cè)結(jié)果

1 676例標(biāo)本進(jìn)行FISH檢測(cè)，240例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陽性，陽性率為14.31%。21三體(47，XN，+21)140例，18三體(47，XN，+18)44例(18.33%，13三體(47，XN，+13)14例，Klinefelter綜合征(47，XXY)16例，超雌綜合征(47，XXX)8例(3.33%)，Turner綜合征(45，X)5例，超雄綜合征(47，XYY)3例，嵌合體10例。嵌合體包括21三體嵌合體2例，18三體嵌合體2例，Turner綜合征嵌合體4例，超雄綜合征2例，詳見表2。

表2 羊水FISH檢測(cè)結(jié)果

FISH: fluorescence in situ hybridization.

2.3 羊水細(xì)胞核型分析結(jié)果

1 676例標(biāo)本進(jìn)行染色體核型分析檢測(cè)，252例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陽性，陽性率為15.04%。FISH檢測(cè)陽性的240例標(biāo)本，包括：21三體140例，18三體44例，13三體14例，Klinefelter綜合征(47，XXY)16例，超雌綜合征(47，XXX)8例，Turner綜合征(45，X)5例，超雄綜合征(47，XYY)3例，嵌合體10例。染色體核型分析結(jié)果與FISH檢測(cè)結(jié)果一致。與FISH檢測(cè)結(jié)果相比，陽性數(shù)量多出12例，包括一例22號(hào)染色體嵌合、平衡結(jié)構(gòu)重排6例(易位、倒位)、非平衡結(jié)構(gòu)重排1例(缺失)以及多態(tài)4例，詳見表3。

3 討論

本研究對(duì)染色體核型分析和FISH檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)分析，本研究結(jié)果表明，F(xiàn)ISH能夠準(zhǔn)確診斷21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體、X染色體以及Y染色體數(shù)目異常，可以作為臨床依據(jù)對(duì)腹中胎兒進(jìn)行進(jìn)一步處理。FISH檢測(cè)通過計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞的方法來決定羊水細(xì)胞是否攜帶所檢測(cè)染色體數(shù)目異常[5]，這點(diǎn)與染色體核型分析原理一致，其對(duì)嵌合體具有準(zhǔn)確的診斷能力。由于FISH檢測(cè)沒有經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)過程，其所計(jì)數(shù)獲得嵌合體比例具有更接近集體原始狀態(tài)。因此在檢測(cè)嵌合體方面FISH具有很好的檢測(cè)能力，在本研究中，與21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體、X染色體以及Y染色體有關(guān)的嵌合體結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果一致。因此FISH可以對(duì)21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體、X染色體以及Y染色體數(shù)目異常的純合體和嵌合體進(jìn)行準(zhǔn)確診斷[6-7]。

表3 羊水染色體核型分析結(jié)果

FISH: fluorescence in situ hybridization;CR:coincidence rate;BR:balance rearrangement.UBR:unbalanced rearrangement.

染色體畸形兒常伴有多種形態(tài)異常和智力障礙，這些癥狀終生不能完全治愈，為患者家庭帶來的沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。產(chǎn)前診斷過程中，孕有染色體可能畸形胎兒的孕婦具有普遍的焦慮[8]。

無創(chuàng)游離DNA檢測(cè)利用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)算法分析孕婦血液中胎兒游離DNA[9]，可以檢出21三體、18三體以及13三體(一些實(shí)驗(yàn)室也對(duì)性染色體異常進(jìn)行分析)[10]。臨床研究[9]顯示無創(chuàng)游離DNA檢測(cè)的很高的敏感度、特異度以及陽性預(yù)測(cè)值，并且沒有不良反應(yīng)[11]，從而得到孕婦和臨床醫(yī)生的廣泛接受，一些高齡和唐氏篩查高危孕婦會(huì)優(yōu)先選擇無創(chuàng)游離DNA檢查，導(dǎo)致了羊水穿刺數(shù)量下降[12-14]。獲得陽性結(jié)果的孕婦需要進(jìn)行羊水穿刺以確認(rèn)胎兒是否為染色體異常。常規(guī)核型分析檢測(cè)需要經(jīng)歷培養(yǎng)過程，出具報(bào)告時(shí)間多在4周以上，在等待結(jié)果過程中孕婦及其家庭將承受焦慮的痛苦。同時(shí)孕周越大，人工流產(chǎn)給孕婦帶來的損傷越大。因此需要一種快速的確定胎兒染色體核型的方法。

與染色體核型分析相比，F(xiàn)ISH只能檢測(cè)21三體、18三體、13三體以及性染色體(X染色體以及Y染色體)數(shù)目異常，雖然檢測(cè)范圍小于染色體核型分析，但是FISH的檢測(cè)范圍和無創(chuàng)檢測(cè)范圍一致，可以用作對(duì)無創(chuàng)游離DNA檢測(cè)的方法。另外，F(xiàn)ISH檢測(cè)沒有細(xì)胞培養(yǎng)的步驟，最快可以在24 h內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，一般1周內(nèi)能夠獲得檢測(cè)結(jié)果，比染色體核型分析結(jié)果周期縮短3周左右，具有速度優(yōu)勢(shì)。能夠快速確定胎兒染色體核型結(jié)果，可以有效緩解孕婦和家庭的憂慮，同時(shí)根據(jù)FISH結(jié)果盡早進(jìn)行處理，可以減少人流給孕婦帶來的身體損傷。FISH是對(duì)無創(chuàng)游離DNA檢測(cè)陽性結(jié)果確認(rèn)的好方法。

本研究核型分析還檢出了21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體、X染色體以及Y染色體之外的嵌合體、染色體結(jié)構(gòu)異常(易位、倒位、缺失以及多態(tài))，這些染色體畸形均沒有被FISH檢出。因此，在懷疑胎兒攜帶檢測(cè)染色體數(shù)目異常之外的異常時(shí)，不適合FISH檢測(cè)。