沙勒塔娜提·塔拉別克 孫志朋 王璐琪 油紅捷 羅大力

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理系，北京 100069)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病引起的以心肌結構改變和功能減退為特征，獨立于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、瓣膜病變等原因的特異性心肌病[1]。比較公認的是胰島素作用減弱(包括胰島素減少和胰島素抵抗)和慢性血糖升高是DCM發(fā)生發(fā)展的重要原因。能量代謝異常(包括胰島素、血糖、血脂代謝異常)、氧化應激和線粒體損傷、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的異常激活、交感神經和鉀、鈉、鈣等通道電生理紊亂以及多種細胞因子的調節(jié)異常也是DCM發(fā)病的致病因素[2]，但DCM的發(fā)病機制目前仍不明確，且治療手段匱乏。近年來研究[3-4]顯示鈣庫操縱性鈣內流(store operated calcium entry，SOCE)可能參與了DCM心肌肥大發(fā)病過程，但高糖如何影響SOCE的具體機制不清。

Ca2+不僅參與肌纖維興奮-收縮耦聯(lián)過程，還是細胞內重要的第二信使，參與調節(jié)多種細胞活動。細胞外Ca2+內流的主要通道包括電壓門控型鈣通道(voltage gated calcium channels，VGCC)、受體門控型鈣通道(receptor operated calcium channels，ROCC)和由鈣庫操縱的鈣通道SOCE[5-6]。其中SOCE是包括心肌細胞在內的多種細胞Ca2+內流的重要通道之一，主要由基質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)和鈣釋放激活鈣通道調節(jié)分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1，Orai1)組成。STIM1是一種定位在肌漿網(sarcoplasmic reticulum，SR)膜上的單次跨膜蛋白，它的作用為監(jiān)測SR腔中Ca2+濃度[7]，Orai1則主要參與構成細胞膜上的Ca2+通道[8]。當SR腔中的Ca2+耗竭，STIM1蛋白會發(fā)生構象變化并聚集到臨近細胞膜的位置與Orai1相互作用，激活SOCE，介導Ca2+內流[9-11]。SOCE參與了多種心血管系統(tǒng)疾病的病理生理過程。然而，高糖環(huán)境是否影響心肌SOCE介導的Ca2+內流并不清楚。因此，本實驗旨在通過高糖刺激大鼠胚胎心肌細胞系(H9C2)和培養(yǎng)的乳大鼠心室肌細胞(neonatal rat ventricular myocytes，NRVMs)，探究SOCE的變化以及可能的作用機制，為深入研究高血糖導致的心肌細胞鈣信號紊亂的分子機制和糖尿病心肌病的發(fā)病原因提供新的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠胚胎心肌細胞系H9C2購自中國科學院上海生命科學研究院，胎牛血清購自美國Gibco公司，DMEM和M199培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，葡萄糖購自美國Gibco公司，青-鏈霉素混合液購自北京索萊寶公司，毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)購自美國Sigma公司，STIM1以及Orai1單克隆抗體購自美國Santa公司，驢抗兔熒光二抗-FITC購自美國Invitrogen公司，Calnexin以及GAPDH鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司，瓊脂糖G珠購自美國Invitrogen公司，F(xiàn)luo-4 AM鈣離子熒光探針購自日本Dojindo研究所，膠原酶Ⅱ購自美國Worthington Biochemical公司，胰酶購自北京索萊寶公司。

1.2 SD乳大鼠心室肌細胞的分離培養(yǎng)與純度鑒定

選擇出生48 h內SD乳大鼠40只，用手術剪沿乳大鼠中部偏左剪開胸骨，暴露出心臟，剪下心臟，小心去除心房及心臟周圍的大血管，保留心室部分，收集至10 mL血清瓶中，將組織剪碎。加入5 mL HBSS消化液[含0.1%(質量分數(shù))胰蛋白酶和 0.03%Ⅱ型膠原酶]，置恒溫磁力攪拌器上，37 ℃恒溫消化5 min。第一次消化結束后，用玻璃吸管吸出上清丟棄。再加入5 mL HBSS消化液，37 ℃恒溫消化5 min，消化結束后用玻璃吸管將細胞懸液吸入15 mL離心管中，并在離心管中加入含10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM終止消化。在血清瓶中再加入5 mL HBSS消化液，按上述步驟依次消化，共計10次。將15 mL離心管中的細胞懸液在1 000 r/min條件下離心5 min后棄去上清，加入3 mL含10%(體積分數(shù))胎牛血清M199完全培養(yǎng)基重懸細胞，用200目篩網過濾細胞懸液至100 mm細胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中靜置2 h，然后利用差速貼壁法去除優(yōu)先貼壁的成纖維細胞。重新收集細胞懸液，補充M199完全培養(yǎng)基，并將血清含量調整至15%(體積分數(shù))，放置在培養(yǎng)箱中，37 ℃，5%(體積分數(shù)) CO2條件下培養(yǎng)。 24 h 后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細胞。繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。

NRVMs純度鑒定：取培養(yǎng)48 h的NRVMs心肌細胞，用橫紋肌肌動蛋白(α-actin)單克隆抗體作為一抗進行免疫細胞化學染色。隨機選取10個高倍(20×)視野計數(shù)陽性細胞及細胞總數(shù)，以陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%≥95%作為細胞純度合格指標。通過以上方法分離的心室肌細胞純度均達95%以上，此外，在分離細胞培養(yǎng)至24 h 后可以觀察到NRVMs心肌細胞成片自主搏動現(xiàn)象，表明本實驗細胞所產生的反應是來自心肌細胞。

1.3 鈣離子探針孵育心肌細胞

Fluo4-AM母液的配制：用4 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解50μg的Fluo4-AM粉末配制成4 mmol/L的Fluo4-AM母液。-20 ℃避光密封保存。用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋Fluo4-AM 母液，配制成4 μmol/L工作液。向共聚焦皿中加入 Fluo4-AM 工作液覆蓋細胞后37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育40 min。用有鈣(1.8 mmol/L)臺氏液(pH=7.35～7.4)輕輕浸洗細胞3次，以充分去除殘留的Fluo4-AM工作液，然后加入1 mL無鈣臺氏液覆蓋細胞備用。

將負載好熒光染料的心肌細胞放在激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的載物臺上，設置參數(shù)：激發(fā)波長488 nm，接收波長516 nm，40×物鏡，最快速度連續(xù)掃描，所有圖像在同一條件下(針孔大小、光電倍增管增益等)采集。調節(jié)焦平面位置選取合適的細胞層面，記錄細胞內鈣離子初始熒光強度值(F0)，待細胞穩(wěn)定后向共聚焦皿中輕輕加入2 μmol/L毒胡蘿卜素，連續(xù)記錄產生的Ca2+釋放熒光強度變化值(F)。待細胞鈣信號回到靜息狀態(tài)時，輕輕滴加1.8 mmol/L CaCl2溶液，連續(xù)記錄瞬時Ca2+內流熒光強度變化值(F)至細胞恢復靜息狀態(tài)。以上實驗均在室溫條件下進行，重復3次。實驗數(shù)據(jù)分析：以每個細胞Ca2+離子熒光強度變化值與Ca2+離子初始熒光強度值的比值，即F/F0作為細胞Ca2+內流或Ca2+釋放的熒光強度值進行統(tǒng)計分析。

1.4 免疫共沉淀

在10 cm培養(yǎng)皿中接種2.4×107個心肌細胞，分為2組：對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)，高糖組(25 mmol/L葡萄糖)，每組共3個皿。將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5% (體積分數(shù))CO2的培養(yǎng)箱孵育48 h后收集各組細胞，加入適量NP-40細胞裂解液，4 ℃ 搖床緩慢搖晃1 h后離心(12 000 g，15 min)取上清液。加入20 μL Protein G瓊脂糖珠，4 ℃ 搖床緩慢搖晃預吸附2 h后離心去除珠子，再根據(jù)蛋白濃度加入適量STIM1抗體過夜。次日取20 μL Protein G瓊脂糖珠加入到細胞裂解液中，4 ℃ 搖床緩慢搖晃孵育4 h，使抗體與Protein G瓊脂糖珠充分偶聯(lián)。免疫沉淀反應后，離心(200 r/min，3 min) 棄上清，用細胞裂解液輕輕清洗瓊脂糖珠，再離心(200 r/min，3 min)，保留瓊脂糖珠沉淀，重復3次。最后向瓊脂糖珠加入25 μL的1×SDS上樣緩沖液，95 ℃ 5 min，進行后續(xù)SDS-PAGE電泳及Western blotting蛋白檢測。實驗重復3次。

1.5 化學交聯(lián)

在6 cm培養(yǎng)皿中接種9×106個心肌細胞，分為2組：對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)，高糖組(25 mmol/L葡萄糖)，每組共3個皿。將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5%(體積分數(shù)) CO2的培養(yǎng)箱孵育48 h后用無鈣臺氏液輕輕清洗兩遍，然后加入2 μmol/L 毒胡蘿卜素刺激細胞5 min，再加入1%(質量分數(shù))多聚甲醛室溫固定蛋白質間相互作用6～8 min，最后加入0.1 mol/L甘氨酸冰浴5 min終止甲醛反應。收集細胞加入適量裂解液，超速離心(38 000 g，90 min，4℃)后去除上清，加入適量裂解液溶解蛋白沉淀進行BCA測定濃度。進行后續(xù)SDS-PAGE電泳及Western blotting蛋白檢測。與普通Western blotting實驗不同，該蛋白樣品不經過煮沸處理。實驗重復3次。

1.6 細胞免疫熒光

取細胞培養(yǎng)12孔板，在每個孔板內放置玻璃爬片，在每個爬片上接種5×105心肌細胞，分為2組：對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)，高糖組(25 mmol/L葡萄糖)，將孔板置于37 ℃，5% (體積分數(shù))CO2的培養(yǎng)箱孵育48 h。吸去培養(yǎng)基，臺氏液輕輕浸洗細胞3次，每次5 min。向孔內加入2 μmol/L 毒胡蘿卜素刺激細胞5 min，然后迅速用4%(質量分數(shù))多聚甲醛進行細胞固定，室溫20 min。吸去多聚甲醛，臺氏液浸洗細胞3次。向孔內加入0.1% (體積分數(shù))Triton X-100，室溫破膜30 min，使細胞通透。除去Triton X-100，臺氏液浸洗3次，每次5 min。用5%(質量分數(shù))BSA封閉30 min。封閉后無須清洗，向每孔滴加STIM1抗體[1∶50，5%(質量分數(shù))BSA稀釋]，4 ℃濕盒內孵育過夜12 h。次日，吸去一抗，臺氏液浸洗細胞3次，每次5 min。向孔內滴加驢抗兔熒光二抗-FITC(綠)[1∶500，5% (質量分數(shù))BSA稀釋]，室溫避光孵育1 h。吸去二抗，臺氏液浸洗細胞3次，每次5 min。向玻片上滴加DAPI復染細胞核，避光室溫孵育10 min。臺氏液浸洗細胞，用鑷子輕輕取出爬片，用抗熒光淬滅劑封片，將爬片反過來貼于載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。為了分析STIM1 puncta結構的變化，首先按照相同的成像數(shù)據(jù)采集各組熒光圖像，然后通過Image J軟件對puncta面積進行計算。其中將面積>0.5 μm2的顆粒物定義為puncta,每組隨機選取30～40個細胞作為統(tǒng)計樣本,實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 高糖對H9C2和NRVMs心肌細胞SOCE功能的影響

與對照組相比，高糖組H9C2(圖1A)以及NRVMs (圖1B)心肌細胞的鈣庫排空能力差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但加入CaCl2溶液1.8 mmol/L后，高糖組H9C2產生的Ca2+內流強度高于對照組(P<0.05，圖1A), 高糖組NRVMs產生的Ca2+內流強度也增高(P<0.01，圖1B)。不同組別各選取30～40個狀態(tài)良好的心肌細胞進行Ca2+信號實時記錄并統(tǒng)計，以n=30～40細胞表示，每個組別實驗均重復3次。

圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測高糖對H9C2和NRVMs心肌細胞SOCE的影響

2.2 高糖對H9C2和NRVMs心肌細胞中SOCE相關蛋白表達的影響

與對照組相比，高糖培養(yǎng)的H9C2(圖2A)和NRVMs(圖2B)心肌細胞STIM1蛋白表達均明顯增加 (P<0.01)，且在H9C2全細胞蛋白中Orai1的表達量也升高(P<0.05)。提示高糖上調H9C2和NRVMs心肌細胞SOCE相關蛋白(STIM1和Orai1)表達，各組實驗均重復3次。

圖2 Western blotting檢測高糖對H9C2和NRVMs心肌細胞STIM1和Orai1蛋白表達的影響

圖3 化學交聯(lián)法檢測高糖對NRVMs 心肌細胞STIM1蛋白聚集體形成的影響

2.3 高糖對NRVMs心肌細胞STIM1蛋白聚集化的影響

圖4 免疫熒光染色觀察高糖對NRVMs細胞STIM1蛋白聚集體形成的影響

在沒有經TG刺激時，兩組心肌細胞SR蛋白抽提物中STIM1聚集體(STIM1 polymers)無明顯差異；接下來，經TG刺激排空鈣庫后，與對照組相比，高糖組STIM1蛋白高分子量聚集體(約260 000以上)顯著增多(圖3)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。為了進一步驗證上述蛋白交聯(lián)結果，對兩組NRVMs心肌細胞STIM1蛋白進行免疫熒光檢測。結果顯示，在靜息狀態(tài)下，對照組和高糖組細胞STIM1蛋白熒光染色差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；但經TG刺激排空鈣庫后，高糖組細胞STIM1形成的斑點狀蛋白聚集體結構(puncta)與對照組明顯不同(圖4)。結果顯示，與對照組相比，高糖組細胞STIM1 puncta的單個面積顯著增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且可見形成的puncta遠離核周，朝胞膜方向位移。提示鈣庫排空后高糖過度促進STIM1蛋白激活形成聚集體。

圖5 免疫共沉淀法檢測正常糖和高糖條件下NRVMs中內源性STIM1與Orai1蛋白的相互作用

2.4 高糖對NRVMs心肌細胞中STIM1與Orai1相互作用的影響

與STIM1免疫共沉淀的蛋白復合物中可檢測到Orai1單體(約34 000)和聚集體(約160 000)，說明經藥物刺激后心肌細胞內STIM1與Orai1蛋白確實存在相互作用，但對照組與高糖組間這兩種蛋白相互作用情況并無明顯差異(圖5)。提示高糖異常激活SOCE的機制可能不是通過促進STIM1和Orai1直接相互作用。

3 討論

STIM1和Orai1是構成 SOCE的重要蛋白分子。STIM家族由兩種蛋白亞型組成：STIM1和STIM2，在研究[12]顯示STIM1是定位于SR膜上的單次跨膜蛋白，具有監(jiān)測SR腔內Ca2+濃度的傳感作用。其NH2末端位于SR腔內，包括典型的EF-hand結構域 (canonical EF-hand domain，cEF)、非Ca2+結合EF-hand結構域 (non-Ca2+binding hidden EF-hand domain，hEF) 和α卷曲模體結構域(sterile alpha motif domain，SAM)[13-14]。雖然Ca2+只與cEF結構域結合，但是hEF-hand-SAM結構域的穩(wěn)定性對Ca2+傳感作用非常重要。在靜息狀態(tài)下，Ca2+與STIM1的cEF-hand結合，STIM1通過螺旋結構域間的相互作用形成二聚體[15]。當SR Ca2+存儲減少時，Ca2+從STIM1的cEF結構域脫離，導致hEF-hand-SAM復合物中的疏水殘基暴露，啟動STIM1聚集反應[16]。然而與STIM1相比，STIM2具有明顯不同的NH2末端區(qū)域[17]，STIM2在SOCE調節(jié)中的作用目前尚不清楚。Orai家族成員包含三個高度保守的同系物：Orai1，Orai2和 Orai3，其中Orai1是位于細胞膜上包含四個跨膜結構域的通道蛋白[18]，是最重要的SOCE效應蛋白。已知Orai1在靜息條件下以均二聚體或四聚體形式存在[19]。激活后，形成六聚體[20]并介導鈣釋放激活的鈣離子通道(calciumrelease-activated calcium，CRAC)開放。當SR充盈時，STIM1與Ca2+結合并散在分布于SR膜上。一旦SR內Ca2+排空，STIM1發(fā)生構象變化，迅速寡聚化并遷移到與質膜緊密靠近的區(qū)域形成斑點狀puncta結構。STIM1的重新定位觸發(fā)Orai1向SR-PM接觸位點的募集，最終通過STIM1與Orai1相互作用，激活SOCE，介導Ca2+內流[21-26]。

研究[27-30]表明，SOCE功能障礙與心肌疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。與非興奮細胞一樣，乳大鼠心室肌細胞能夠對肌漿網Ca2+儲備的耗竭做出反應，通過不同于VGCC的通道引起細胞外Ca2+內流，這種途徑已被證明是SOCE[31]。Voelkers等[32]也證實了乳大鼠心肌細胞中有STIM1和Orai1蛋白表達以及SOCE介導的Ca2+內流參與心肌細胞病變過程；Ohba等[33]發(fā)現(xiàn)敲除STIM1能夠抑制NRVMs中SOCE效應。上述研究表明，心肌細胞存在SOCE途徑及其效應蛋白STIM1和Orai1可以調控這種Ca2+內流通道。在此基礎上，已有研究[34]顯示高糖可以引起心肌細胞損傷，其機制可能是高糖增加細胞內Ca2+濃度，引起Ca2+超載。有研究[35]表明，體外高糖環(huán)境可抑制H9C2心肌細胞增生，上調STIM1、Orai1及瞬時受體電位陽離子通道蛋白(transient receptor potential cation channel，TRPC1)的表達，提示高糖誘導的H9C2心肌損傷中有SOCE的參與；相反地，Pang等[36]在5.5 mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng)NRVMs，加入TG后胞質Ca2+濃度立即升高，而在30 mmol/L 高糖中培養(yǎng)20 h后NRVMs對TG刺激的反應減弱，表明高糖降低了NRVMs由血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)或TG誘導的SOCE。此外，Correll等[37]發(fā)現(xiàn)，STIM1過表達的心肌細胞SOCE增強，且小鼠早在6周齡就表現(xiàn)出心臟性猝死，而存活超過12周的小鼠則出現(xiàn)心力衰竭伴肥大，胎兒基因程序啟動，組織病理學和線粒體結構改變，心室功能喪失和肺水腫。與此同時，近期有項研究[38]表明，主動脈弓縮窄術(transverse aortic constriction，TAC)誘導的小鼠表現(xiàn)出心肌細胞肥大，SOCE過度激活，但在突變Orai1的R91W16位點后，SOCE趨于正常。以上研究結果說明，SOCE功能障礙以及STIM1、Orai1表達改變均可能誘發(fā)心肌細胞鈣信號紊亂，然而在高糖條件下心肌細胞SOCE的變化比較矛盾，其機制也尚不清楚。

心肌細胞功能障礙既是心肌病變的始動原因，也是促進疾病發(fā)展的重要因素，而且高血糖以心肌細胞為靶點，損害心臟的機械性能[39]。因此，保護心肌細胞對維護心臟健康有重要意義。糖尿病患者合并心血管疾病的發(fā)病率較非糖尿病者明顯增高，為正常者的約2.5倍，其致病機制與離子通道密切相關[40]。近年的研究[41]證實，糖尿病患者在慢性發(fā)展過程中心肌細胞內靜息Ca2+升高，心臟收縮舒張功能受損，其中涉及的Ca2+超載機制復雜。筆者以高糖對心肌細胞Ca2+內流的影響作為出發(fā)點，從細胞功能變化到分子層面的內在機制進行探究。TG是一種肌漿網鈣泵(Ca2+-ATPase)的抑制劑，可促進細胞內鈣庫排空及誘導SOCE。在本研究中，對照組H9C2心肌細胞和NRVMs與高糖組兩種細胞的鈣庫排空能力(Ca2+release)均差異無統(tǒng)計學意義，說明高糖可能沒有改變肌漿網內Ca2+含量。但高糖組兩種心肌細胞由SOCE介導的Ca2+內流強度均顯著高于對照組。另外，根據(jù)Western blotting結果可知，在H9C2心肌細胞及NRVMs中構成SOCE的兩種主要蛋白STIM1及Orai1均有表達，這與之前的研究[32-33]一致，且用高糖培養(yǎng)以上兩種心肌細胞48 h后，STIM1及Orai1的表達明顯上調。已知鈣庫排空能夠誘發(fā)肌漿網膜上STIM1蛋白變構激活發(fā)生聚集反應，形成斑點狀蛋白聚體體結構(puncta)[42-43]，在本實驗中發(fā)現(xiàn)高糖可以促進STIM1蛋白的這種激活反應，形成更豐富的聚集體，而這種現(xiàn)象有助于激活質膜上的Orai1鈣離子通道，過度開放SOCE，這與筆者在檢測Ca2+信號時看到的高糖增強Ca2+內流的結果相一致。為了進一步驗證高糖對心肌細胞SOCE的影響，筆者用免疫共沉淀實驗對NRVMs心肌細胞內源性STIM1及Orai1的相互作用進行檢測，發(fā)現(xiàn)對照組與高糖組STIM1免疫沉淀的Orai1單體及類聚集體并無明顯差異。根據(jù)以上實驗結果，筆者猜測：等同的時間與空間里，在充足外Ca2+環(huán)境下，高糖組心肌細胞SOCE介導的Ca2+內流顯著增多，是由于高糖誘導STIM1和Orai1蛋白表達上調，使單位時間內SOCE啟動所需的開放通道增多，而不是通過增強STIM1與Orai1之間的相互作用，然而這一猜想有待后續(xù)研究。

糖尿病是世界范圍內最常見的慢性病之一。這文重點關注的是糖尿病患者中一種特殊的心臟合并癥——糖尿病性心肌病變。本文首先探究了高糖對心肌細胞SOCE功能的影響。接下來，重點放在高糖如何改變心肌細胞的SOCE，并發(fā)現(xiàn)是通過上調組成SOCE的蛋白表達，同時促進STIM1蛋白變構聚集，從而誘導SOCE異常激活，增加Ca2+內流，這可能是糖尿病導致的心肌細胞鈣信號紊亂的機制之一，為SOCE參與糖尿病心肌疾病的發(fā)病機制提供了新的依據(jù)。