楊翠翠 包訓(xùn)杰 張 麗 李雅莉 李 林 張 蘭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部 北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，2015年全球AD患者有4 600萬(wàn)，預(yù)計(jì)全球每年AD發(fā)病例數(shù)為770萬(wàn)，或每3 s則產(chǎn)生一名患者[1-2]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，已有近200種治療AD的藥物進(jìn)入人體試驗(yàn)階段，美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)僅批準(zhǔn)6個(gè)AD治療藥物，但這些藥只能暫時(shí)緩解癥狀[3]。中國(guó)人口快速老齡化，AD患病基數(shù)大，就診率增高。開(kāi)發(fā)新的有效治療AD的藥物，改善患者生活質(zhì)量，減少社會(huì)及家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)刻不容緩[4]。

AD又被認(rèn)為是突觸相關(guān)的一類(lèi)疾病，因此又稱(chēng)為突觸失效，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系受損，認(rèn)知功能及記憶能力的下降。因此，改善突觸相關(guān)蛋白表達(dá)和功能障礙是改善認(rèn)知缺陷和防止AD發(fā)展的一個(gè)重要目標(biāo)[5-6]。

山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside, CIG)是從傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥山茱萸中提取的主要有效成分。CIG對(duì)APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因(3×Tg)動(dòng)物模型具有改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其主要機(jī)制為增高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量、減少Aβ沉積、抑制tau蛋白的病理改變[7]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CIG對(duì)模型小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白的影響，并探討不同月齡3×Tg小鼠的腦內(nèi)突觸及其影響因素的變化特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥物

CIG(批號(hào)：071207)，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室自行研制。山茱萸為市售(產(chǎn)地河南西峽)，經(jīng)水提、醇沉、大孔吸附樹(shù)脂層析，提取和分離獲得CIG，純度為70%(其中莫諾苷含量為67%，馬錢(qián)苷含量為33%)達(dá)到國(guó)家中藥、天然藥物5類(lèi)新藥的要求。CIG為棕黃色粉末，水溶性好。實(shí)驗(yàn)中采用干粉劑量，溶解于蒸餾水，制成藥液應(yīng)用。

1.2 動(dòng)物分組及給藥

3×Tg小鼠，購(gòu)自美國(guó)Jackson Lab公司，經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室擴(kuò)增繁殖，每只均經(jīng)過(guò)基因型鑒定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0016。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境是開(kāi)燈/關(guān)燈每天各12 h，恒溫(23±1) ℃，食物和水自由攝取。

(1) 7月齡：對(duì)照組：野生型(wild type,WT)小鼠11只；模型組：3×Tg小鼠11只；給藥組：3×Tg+CIG 200(200 mg/kg)11只。每日1次灌胃給予等體積CIG或者蒸餾水，從7月齡持續(xù)至9月齡。

(2)16月齡：對(duì)照組： WT小鼠8只，WT+CIG低劑量組(100 mg/kg)9只；模型組：3×Tg小鼠7只；藥物治療組：3×Tg+CIG低劑量組(100 mg/kg)7只，3×Tg+CIG高劑量組(200 mg/kg)7只。每日1次灌胃給予等體積CIG或者蒸餾水，從16月齡持續(xù)至18月齡。

1.3 試劑與儀器

兔抗淀粉樣前體蛋白(amyloid precurson protein,APP)抗體(1∶500), 兔抗IDE抗體(1∶10 000), 兔抗Bace1抗體(1∶10 000), 兔抗tau-5抗體(1∶1 000)，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗ADAM10抗體(1∶10 000), 兔抗PS1抗體(1∶10 000), 兔抗Synapsin I 抗體(1∶1 000), 兔抗Synaptophysin抗體(1∶1 000), 兔抗Synaptotagmin 抗體(1∶1 000)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 兔抗tau-Ser404抗體(1∶1 000), 兔抗tau-Ser199/202抗體(1∶1 000)，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；小鼠抗β-actin抗體(1∶2 000)，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，美國(guó)Santa Cruz公司。FluoChem化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Protein Simple公司；圖像分析系統(tǒng)：Image-pro Plus型，購(gòu)自美國(guó)Media Cybernetics公司；電泳儀：PowerPac200型，購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.4 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

利用嚙齒類(lèi)動(dòng)物喜歡對(duì)新的物體進(jìn)行探測(cè)的行為來(lái)判斷動(dòng)物是否記住先前遇到過(guò)的舊物體，如果記住舊的物體，則動(dòng)物應(yīng)對(duì)舊物體的探索時(shí)間少于新的物體。結(jié)果用分辨指數(shù)來(lái)表示，分辨指數(shù)越高表示動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力越好，反之，則學(xué)習(xí)記憶能力差。實(shí)驗(yàn)主要分為適應(yīng)期、熟悉期和識(shí)別期。第1天為適應(yīng)期：小鼠放于良好光線照射的方盒中(燈要放置于盒子的上方，不能偏離兩端)，自行適應(yīng)性活動(dòng)10 min。第2天為熟悉期：在方盒中放入2個(gè)相同的紅色塑料瓶(4 cm×4 cm)，距離邊壁8 cm，讓小鼠在盒中10 min，記錄其在每個(gè)物體上的探索時(shí)間(以鼠的嘴湊近物體<0.5 cm，嘴的方向必須對(duì)著物體才計(jì)入，站在玩具上玩不能計(jì)入)。每只秒表對(duì)應(yīng)1個(gè)物體計(jì)時(shí)。第3天為識(shí)別期：將另外一個(gè)棕色玻璃瓶放入方盒，替換其中的一個(gè)舊物體(注意要依次更換替代物體的位置)，測(cè)定小鼠探索每個(gè)物體的時(shí)間。計(jì)算統(tǒng)計(jì)第3天各組小鼠在新物體上的分辨指數(shù)，公式為：分辨指數(shù)=(新物體時(shí)間-舊物體時(shí)間)/(新物體時(shí)間+舊物體時(shí)間)。

1.5 免疫印跡法

取出腦組織后置于冰上將海馬及皮質(zhì)分離后，放入液氮中速凍，于-80 ℃保存。將凍存于-80 ℃冰箱中的小鼠海馬/皮質(zhì)組織取出并稱(chēng)質(zhì)量，加入裂解液裂解，之后提取蛋白并定量。蛋白經(jīng) SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，與上述一抗、二抗孵育后，在暗室將超級(jí)化學(xué)發(fā)光底物 A 液與 B 液等量混合，立即加到膜上，0.8 mL /膜，滴勻液體，反應(yīng) 2 min，然后用濾紙吸去多余熒光劑，將膜放到化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中曝光 10 s～5 min。將圖片存為T(mén)IFF格式。選擇曝光度適中，條帶較為清晰的TIFF圖片采用TINA軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CIG對(duì)3×Tg小鼠記憶功能的影響

7月齡組內(nèi)各觀察組間小鼠分辨指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。16月齡組內(nèi)各觀察組間小鼠分辨指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，3×Tg小鼠分辨指數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；CIG(200 mg/kg)灌胃給藥2個(gè)月使16月齡3×Tg小鼠的物體分辨指數(shù)顯著提高(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 CIG對(duì)3×Tg小鼠分辨指數(shù)的影響 Tab.1 Effect of CIG on discrimination

n=7-11 per group；#P<0.05vsWT group，*P<0.05vs3×Tg group；WT: wide type;3×Tg:APP/PS1/tautransgenic mice;3×Tg+CIG200:APP/PS1/taumice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;CIG: cornel iridoid glycoside.

2.2 CIG對(duì)3×Tg小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

7月齡組內(nèi)各觀察組間小鼠腦內(nèi)主要突觸相關(guān)蛋白synapsin-1、synaptotagmin、synaptophysin表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖1。16月齡組內(nèi)各觀察組間小鼠腦內(nèi)主要突觸相關(guān)蛋白synapsin-1表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，3×Tg小鼠腦內(nèi)synapsin-1表達(dá)量明顯低于對(duì)照組小鼠(P<0.01)，CIG可以提高其表達(dá)(P<0.01)。而synaptotagmin和synaptophysin表達(dá)水平，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖1 CIG對(duì)7月齡組3×Tg小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白的影響

圖2 CIG對(duì)16月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白的影響

2.3 CIG對(duì)7月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)APP及其代謝相關(guān)蛋白的作用

應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)7月齡3×Tg小鼠皮質(zhì)APP及其代謝相關(guān)蛋白的作用，全長(zhǎng)APP(full length amyloid-β precursor protein, FL APP)、α分泌酶(recombinant a disintegrin and metalloprotease 10, ADAM10)、β分泌酶(β-site APP-cleaving enzyme 1, BACE1)、γ分泌酶成分蛋白(preclinical presenilin1, PSEN1)、胰島素降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)的表達(dá)在模型組與對(duì)照組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給與CIG后對(duì)模型動(dòng)物無(wú)影響(圖3)。

圖3 CIG對(duì)7月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)APP及其代謝相關(guān)蛋白的影響

2.4 CIG對(duì)7月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響

應(yīng)用Western blotting法對(duì)7月齡小鼠大腦皮質(zhì)tau蛋白蘇氨酸(Ser)199/202位點(diǎn)和絲氨酸(Ser)404位點(diǎn)的磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。7月齡3×Tg小鼠皮質(zhì)tau蛋白磷酸化水平和對(duì)照組小鼠相比并未發(fā)生明顯改變，且給予CIG治療組也未發(fā)生變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖4。

圖4 CIG對(duì)7月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響

3 討論

AD是一種神經(jīng)退行性疾病，在癡呆中較為常見(jiàn)，臨床以記憶障礙最為常見(jiàn)?；颊吣X內(nèi)出現(xiàn)由beta-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaques，SP)，并伴隨突觸丟失、突觸相關(guān)蛋白的減少[8-9]。選擇能夠貼近AD發(fā)病臨床表現(xiàn)的動(dòng)物模型對(duì)于疾病的研究和新藥藥效評(píng)價(jià)至關(guān)重要。3×Tg小鼠能夠呈現(xiàn)AD的主要神經(jīng)病理學(xué)特征，出現(xiàn)大腦神經(jīng)元死亡、突觸丟失等 AD 的重要病理變化，能真實(shí)地模擬AD臨床過(guò)程和病理改變[10]。

AD患者腦額葉和頂葉突觸蛋白水平與正常同齡人相比，synaptotagmin，synapsin-1[11]，synaptophysin明顯下降[12]。目前已在AD患者腦內(nèi)檢測(cè)出有大量突觸丟失，而且突觸丟失與AD患者認(rèn)知功能下降密切相關(guān)[13]?？梢?jiàn)，在AD腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)生異常變化，導(dǎo)致突觸傳遞受損，從而影響認(rèn)知功能。神經(jīng)遞質(zhì)釋放受多種突觸前蛋白調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示7月齡3×Tg小鼠學(xué)習(xí)記憶功能沒(méi)有發(fā)生明顯的損傷，而且腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白synapsin-1、synaptophysin及synaptotagmin也沒(méi)有明顯的增加。16月齡模型小鼠不僅學(xué)習(xí)記憶功能明顯降低，且腦內(nèi)synapsin-1也明顯減少。Synapsin-1是第一個(gè)被確定的突觸前蛋白也是突觸囊泡上含量最豐富的蛋白[14]。本研究結(jié)果提示synapsin-1在此轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病過(guò)程中更容易受到致病因素的影響從而發(fā)生改變。

腦內(nèi)Aβ和tau蛋白異常過(guò)度磷酸化能夠減少突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)[15]。Aβ 是由其前體蛋白APP 經(jīng)BACE1分泌酶水解產(chǎn)生的。ADAM-10將APP水解成具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用sAPPα，不產(chǎn)生Aβ。IDE在腦內(nèi)能夠降解Aβ以及APP胞內(nèi)段，其降解產(chǎn)物喪失聚集以及沉積能力，毒性降低[16-17]。研究[18]顯示，IDE的表達(dá)受早老素1(presenilin-1，PS1)多變體的影響，并且隨著PS1的增多，IDE的表達(dá)和活性有所降低，導(dǎo)致Aβ42水平的增加。本實(shí)驗(yàn)在7月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)APP及其代謝蛋白和tau蛋白的磷酸化沒(méi)有明顯的改變，但本課題組[7]前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)16月齡小鼠腦內(nèi)具有明顯的Aβ沉積和tau蛋白異常過(guò)度磷酸化。這提示，APP和tau在7月齡小鼠腦內(nèi)未出現(xiàn)異常變化，所以不能引起突觸相關(guān)蛋白的改變。

研究[19]顯示，3×Tg小鼠在6月齡即出現(xiàn)APP及tau蛋白的異常，但本實(shí)驗(yàn)在7月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)沒(méi)有Aβ和tau蛋白的異常表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)病理變化受小鼠品系背景影響。研究[20]顯示，C57BL/6J對(duì)于APP基因過(guò)表達(dá)更加易感，比以DBA/2為背景的轉(zhuǎn)基因小鼠更早出現(xiàn)Aβ相關(guān)的病理變化。本實(shí)驗(yàn)采用的3×Tg小鼠以129小鼠為背景，因此推斷其對(duì)APP等基因的易感性弱于C57BL/6J小鼠，因此出現(xiàn)相關(guān)病理變化較晚。

Synapsin-1與軸突的延長(zhǎng)和突觸囊泡融合動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)有關(guān)，并且在突觸行程中扮演重要角色[21]。神經(jīng)遞質(zhì)釋放前，囊泡通過(guò)synapsin-1蛋白連接至細(xì)胞骨架上，Ca2+內(nèi)流，突觸囊泡從細(xì)胞骨架解離，進(jìn)入突觸前膜的活性區(qū)，經(jīng)過(guò)一系列的錨定、裝配，鈣離子傳感器synaptotagmin-1由于受到鈣離子信號(hào)，在synaptophysin的參與下觸發(fā)囊泡融合，最終以胞吐方式釋放囊泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)[22-24]。16月齡小鼠給予CIG 2個(gè)月，能夠增加synapsin-1的表達(dá)，提高模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能，提示CIG能夠促進(jìn)突觸形成、囊泡釋放及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，這可能是CIG改善AD模型動(dòng)物認(rèn)知障礙的機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究了7月齡及16月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白及其致病因素的變化，為實(shí)驗(yàn)中選擇合適月齡及品系的模型動(dòng)物提供參考。CIG能夠增加16月齡3×Tg小鼠synapsin-1表達(dá)，為明確CIG改善AD模型動(dòng)物認(rèn)知障礙的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。